楊博超，王鳳雪，溫永俊，李建喜，楊志強(qiáng)，武 華＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）是斷乳仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post－weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原，該病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，病毒直徑17nm左右，為已知的最小的動物病毒之一[1－2]?；糚MWS的豬于1991年在加拿大西部首次發(fā)現(xiàn)，并已在世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失[1，3－4]。PMWS的癥狀主要表現(xiàn)為生長緩慢、貧血、呼吸困難、黃疸等，病理變化包括肉芽腫性間質(zhì)性肺炎，淋巴結(jié)腫大，肝炎和腎病[3]。有研究表明，自然發(fā)生PMWS豬的肝炎致病機(jī)理與PCV－2感染導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡有關(guān)[5]。

PCV－2基因組為共價(jià)閉合的環(huán)狀單鏈DNA，以滾環(huán)方式進(jìn)行復(fù)制[6]。目前在GenBank上發(fā)表的各毒株基因組長度介于1766bp和1769bp之間。不同地區(qū)的PCV－2毒株基因組有一定差異，且近年來有關(guān)PCV－2遺傳變異情況的報(bào)道不斷增多[7－10]，故對PCV－2地方株的分離及基因組序列分析有助于了解該地區(qū)的PCV－2分子流行病學(xué)特征，確定其致病特性和變異情況。本研究從吉林采集的疑似PMWS病死豬體內(nèi)分離出一株P(guān)CV－2，為其相關(guān)病原學(xué)研究提供了材料，對此分離株進(jìn)行了全基因組擴(kuò)增測序及序列分析，為PCV－2的地區(qū)分布差異及變化規(guī)律研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及病料樣品 PK－15細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室保存；病料來自吉林某豬場疑似PMWS病死豬的組織（包括肺、脾、淋巴結(jié)）。

1.1.2 試劑 PCR試劑（包括 ExTaq酶、dNTP Mixture、10×ExTaq buffer）、DL 2000Marker、克隆載體pMD 18－T Vector，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；氨芐青霉素（Amp）和無水乙醇為北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞宿主菌E.coli DH5α由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所人獸共患病研究室保存；DNA提取試劑盒為BioTeke生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒為Axygen（杭州）生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；D－氨基葡萄糖購自Sigma公司。胎牛血清（FBS）、高糖DMEM干粉為Gibco公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的PCV－2抗體為美國VMRD公司產(chǎn)品；其余試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 引物 參照文獻(xiàn)[11]合成1對引物，可擴(kuò)增PCV－2的全基因組。引物序列為：F－PCV－2－SacⅡ：5′－GAA CCG CGG GCT GGC TGA ACT TTT GAA AGT－3′；R－PCV－2－SacⅡ：5′－GCA CCG CGG AAA TTT CTG ACA AAC GTT ACA－3′。引物由Invitrogen（北京）公司合成，為凍干粉，用前溶于滅菌的超純水中，稀釋至100μmol／L，工作濃度為20pmol／μL，置－20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 取豬淋巴結(jié)剪碎研磨后凍融3次、離心，上清過0.22μm濾膜除菌，處理后接種于長至半融合狀態(tài)的PK－15細(xì)胞上，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下孵育1h后棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入維持液，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24h，按文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行D－氨基葡萄糖處理，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收獲培養(yǎng)液，并反復(fù)凍融3次。按上述方法連續(xù)盲傳3次后，收獲培養(yǎng)物備用。

1.2.2 分離病毒鑒定 用免疫熒光方法，首先將上述分離的盲傳細(xì)胞培養(yǎng)物接種于半融合狀態(tài)的PK－15細(xì)胞（96孔板），設(shè)重復(fù)4孔，同時設(shè)陰、陽性對照，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后棄去維持液，用PBS洗滌3次，每次5min，冷丙酮固定細(xì)胞，100μL／孔，4℃30min，棄丙酮，室溫下干燥，用PBS洗滌1次，加入FITC標(biāo)記的PCV－2抗體（PCV－2陽性血清），50μL／孔，37℃避光孵育1h；移去孔內(nèi)液體，PBS洗滌3次，每次5min，在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 全基因組擴(kuò)增 將PK－15細(xì)胞盲傳培養(yǎng)物用核酸提取試劑盒提取病毒的總DNA，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：10×ExTaq buffer 5μL，dNTP Mixture 4μL，上下游引物各1μL，DNA模板5μL，ExTaq酶0.5μL，加重蒸滅菌水補(bǔ)至50μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35個循環(huán)；72℃延伸7min。取PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測。在紫外燈下，迅速切下含目的片段的瓊脂糖凝膠塊，放入1.5mL的Eppendorf管中，以DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，電泳鑒定回收的PCR產(chǎn)物。

1.2.4 PCV－2全基因組測序 將純化回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD 18T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，挑取經(jīng)PCR初步鑒定為陽性的重組菌，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定，篩選出陽性克隆。經(jīng)鑒定正確后，送Invitrogen（北京）公司測序，并進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5 PCV－2系統(tǒng)發(fā)育分析 將測序結(jié)果用NCBI／BlAST在線工具查找GenBank上已登陸的與其有較大相似性的序列。根據(jù)BLAST結(jié)果，選擇部分參考序列，進(jìn)行序列相似性分析。應(yīng)用MEGA4繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，對所選PCV－2全序列進(jìn)行分析。序列的多重比對使用Clustal W方法，在繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹的過程中使用鄰接法。

2 結(jié)果

2.1 分離病毒熒光染色結(jié)果

將分離培養(yǎng)物感染PK－15細(xì)胞后，經(jīng)FITC標(biāo)記的PCV－2陽性抗體染色，在熒光顯微鏡下觀察，可見感染細(xì)胞的細(xì)胞漿內(nèi)和胞核內(nèi)均有較強(qiáng)綠色熒光，而細(xì)胞對照孔則未見到特異性熒光（圖1）。

熒光染色結(jié)果表明已經(jīng)分離到PCV－2病毒，并可被PCV－2抗體特異性識別。將此病毒分離株命名為PCV－2－JL11S。

圖1 分離病毒免疫熒光檢測Fig.1 Immunofluorescence detection of isolated virus

2.2 全基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果

全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳分析，在紫外成像儀下觀察，結(jié)果如圖2顯示。電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增出1800bp左右的特異性片段，與預(yù)期片斷大小相符。

圖2 PCV－2－JL11S株的全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 The electrophoresis of complete genome amplification product of PCV－2－JL11Sstrain

2.3 測序結(jié)果及序列分析

將PCV－2全基因組克隆陽性菌液進(jìn)行測序，將測序所得序列拼接，結(jié)果顯示，PCV－2－JL11S株全長1767bp，分析分別包含編碼Rep和Cap蛋白的ORF1和ORF2。應(yīng)用BLAST工具對測得序列進(jìn)行比對，選14株已提交到GenBank的PCV－2全基因的核苷酸序列，應(yīng)用DNA Star將測得序列與已知PCV－2序列進(jìn)行比較（所選14株P(guān)CV－2全基因序列的GenBank登錄號分別為HM776439、HQ395054、EU148503、HQ395032、HQ395042、HQ395033、HQ395037、HQ395040、AY177626、PCV－2－JL11S、HQ395057、HQ395035、HQ395047、HQ395039、HQ395046）。

分析結(jié)果表明，所比對的全部PCV－2毒株之間相似性很高，介于94.4%～99.8%之間。本試驗(yàn)所測定的PCV－2－JL11S毒株與HQ395035株及HQ395057株之間相似性最高，達(dá)到99.2%。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了更好地了解PCV毒株的遺傳學(xué)特性及相互的親緣關(guān)系，利用MEGA軟件對上述15株P(guān)CV－2病毒全基因組序列繪制了系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹（圖3）。

圖3 PCV－2吉林分離株及其他14株P(guān)CV－2全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the complete genome of PCV－2Jilin strain and other 14strains

從圖3可以看出，PCV－2分成多個分支，歐洲測定株EU148503自成一支，其余14株P(guān)CV－2均為國內(nèi)分離株，但也分為多支。本試驗(yàn)分離PCV－2－JL11S株與HQ395057關(guān)系最近。

3 討論

近年來，PMWS對世界養(yǎng)豬業(yè)影響嚴(yán)重，PCV－2在該病的發(fā)病中扮演重要角色。世界各國針對PCV－2的研究很多，但目前PMWS的發(fā)病機(jī)理仍不明確[13]。有研究指出，不同的基因型在致病性方面也有差異[14]，故分離不同PCV－2毒株為其致病機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。本研究從疑似PMWS的病料中分離出一株P(guān)CV－2，并一次性擴(kuò)增出了該分離株的全基因組序列且進(jìn)行了測定，此方法避免了分段擴(kuò)增的麻煩及拼接錯誤等不利因素的影響，提高了試驗(yàn)的精確性和準(zhǔn)確度。

本試驗(yàn)分離得到的PCV－2吉林毒株與其他地區(qū)毒株的相似性很高，最高可達(dá)99.2%，說明比對用所有PCV－2毒株之間親緣關(guān)系都很近，進(jìn)化上比較保守。通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹可以看出，本試驗(yàn)分離株與HQ395057株親緣關(guān)系較近，處于同一分支內(nèi)。但與2009年吉林PCV－2測序株（HQ395037）在進(jìn)化關(guān)系上較遠(yuǎn)，是由于PCV－2基因變異導(dǎo)致還是由于外源污染物感染導(dǎo)致尚不明確，需進(jìn)行深入研究。分析結(jié)果表明，目前吉林地區(qū)PCV－2毒株存在變異，雖然變異程度不大，但這提示我們在PCV－2所導(dǎo)致的疾病預(yù)防控制過程中要對其基因變異情況時刻關(guān)注，并深入分析其變異根源。

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