王 聰，張洪亮，黃 娟，靳繼惠，王怡男，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266109）

犬瘟熱（Canine distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）引起犬科（犬、狐、貉等）、鼬科（水貂、雪貂、黃鼬等）、靈貓科（果子貍）及一部分浣熊科動物的一種急性、亞急性、接觸性傳染病，是當(dāng)前對養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)和野生動物保護(hù)業(yè)危害最大的疫病之一［1］。研究表明，CDV具有比以前設(shè)想的更廣的宿主范圍［2］，免疫動物暴發(fā)犬瘟熱的病例在世界多個國家和地區(qū)也都有報道［3］。細(xì)胞表面受體為病毒的組織嗜性和感染宿主范圍的決定因素，CDV的跨種間傳播現(xiàn)象與其感染宿主的細(xì)胞受體的表達(dá)有著密切關(guān)系［2］。因此，研究CDV受體的特性、功能及其與病毒蛋白相互作用的機(jī)制，不僅有助于闡述病毒致病機(jī)理，對研制更有效的抗病毒藥物、疫苗和診斷試劑也具有重大的理論與現(xiàn)實(shí)意義。

Tatsuo H等［4］發(fā)現(xiàn)人的信號淋巴細(xì)胞激活因子（Signal lymphocyte activation molecule，SLA M），又稱CD150，為麻疹病毒感染的細(xì)胞受體后，其又通過CDV野毒株在穩(wěn)定表達(dá)SLAM的CHO細(xì)胞上感染試驗(yàn)相繼證實(shí)犬的SLAM為CDV感染胞上高水平表達(dá)，對調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)抗體和各種免疫因子產(chǎn)生具有重要作用［7］。因此，CDV的感染能造成動物機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞，從而致使動物因免疫缺陷而感染其他病原造成較高的病死率。受體SLAM的分子差異決定了麻疹病毒屬病毒的宿主嗜性［8］。但是，目前關(guān)于CDV與受體SLAM 相互作用的具體機(jī)制還不完全清楚。

本研究通過將水貂的SLAM基因連接到高效表達(dá)載體pGEX-6p-1，將原核重組質(zhì)粒于E.coli BL21宿主菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對其進(jìn)行定性鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆質(zhì)粒pMD18-T-SLAM（含水貂SLAM基因）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所饋贈；pGEX-6p-1原核表達(dá)質(zhì)粒，感受態(tài)大腸埃希菌（E.coli）DH5α、BL21均為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SalⅠ，SolutionⅠ均購自寶生物工程（大連）有限公司；San Prep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)粒小劑量提取試劑盒購自美國Omega Bio-Tek公司；鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體、兔抗鼠IgG（HRP）購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；一站式GST標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank收錄的SLAM序列（登錄號：FJ626692），利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對特異性引物，并在引物上、下游的5′端分別引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列 為：上 游 引 物：5′-CGGAATTCATGGATCCCAAGAGGCTTCT-3′， 下 游 引 物：5′-GC GTCGACTCAGCTCTCTGGAAGTGTCAC-3′（下劃線處為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)）。PCR產(chǎn)物大小預(yù)計(jì)約為1 035bp。

以質(zhì)粒pMD18-T-SLAM為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR擴(kuò)增體系為25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，上、下游引物各0.5μL，dNTP Mixture 2μL，模板2μL，ddH2O 17μL，TaqDNA 聚合酶0.5μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；94℃30s，55℃1min，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-SLAM的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳回收，進(jìn)一步用San Prep柱式DNA膠回收試劑盒純化DNA。采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ對PCR產(chǎn)物和pGEX-6p-1分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用SolutionⅠ于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組表達(dá)載體的鑒定采用PCR及雙酶切鑒定，并送北京六合華大基因科技（青島）股份有限公司測序。

1.2.3 SLAM-GST在大腸埃希菌BL21中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-SLAM轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21，挑取單個克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃、220r／min振蕩過夜。取過夜的菌液按1∶100比例接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃劇烈振蕩2h～3h，待菌液濃度達(dá)OD 600nm=0.6～0.8時，加入異丙 基硫 代-β-D-半 乳 糖 苷 （IPTG）至 終 濃 度 為1.0mmol／L，于 37℃ 誘 導(dǎo) 5h，取 樣 進(jìn) 行 SDSPAGE電泳。同時設(shè)BL21／pGEX-6p-1對照及未誘導(dǎo)的BL21／pGEX-6p-1-SLAM對照。

1.2.4 表達(dá)產(chǎn)物的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)后的BL21／pGEX-6p-1-SLAM菌液經(jīng)GST標(biāo)記蛋白質(zhì)微量純化套裝進(jìn)行純化，分別取純化前和純化后產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的 Western blot分析 分別誘導(dǎo)BL21／pGEX-6p-1-SLAM 和 BL21／pGEX-6p-1，取誘導(dǎo)后的菌液及未誘導(dǎo)的菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜，220V，2h，取出轉(zhuǎn)印膜，用100g／L脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶1 000鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體，孵育4h，再加入1∶2 000稀釋的羊抗鼠-HRP二抗，DAB顯色。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增

水貂SLAM基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10g／L瓊脂糖凝膠中可見到一條1 035bp左右的特異性條帶（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增SLAM基因Fig.1 SLAM gene amplified by PCR

2.2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-6p-1-SLAM的構(gòu)建與鑒定

將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-SLAM用EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)2條特異條帶，其中一條大小為4 984bp，另一條為1 035bp左右。表明目的基因已經(jīng)插入到質(zhì)粒pGEX-6p-1的相應(yīng)克隆位點(diǎn)中（圖2），DNA序列分析結(jié)果表明，插入片段具有正確的閱讀框。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-SLAM雙酶切鑒定Fig.2 The recombinant plasmid pGEX-6p-1-SLAM digested by restriction enzymes

2.3 SLAM-GST在大腸埃希菌中的表達(dá)

pGEX-6p-1-SLAM重組轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG于37℃誘導(dǎo)5h后，細(xì)菌裂解上清液在66.4ku附近出現(xiàn)一蛋白條帶，與預(yù)期大?。?3.2ku）基本一致，而空載體轉(zhuǎn)化菌經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)26ku的GST蛋白（圖3）。

2.4 SLAM-GST的純化

經(jīng)純化獲得較純的重組蛋白（圖4）。

圖3 SDS-PAGE鑒定目的蛋白的表達(dá)Fig.3 The expressed protein identified by SDS-PAGE

圖4 重組蛋白的純化Fig.4 Purification of recombinant protein

2.5 Western blot分析

結(jié)果顯示，SLAM-GST融合蛋白能與鼠抗GST標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5），表明該表達(dá)蛋白具有良好的抗原性。

圖5 Western blot鑒定目的蛋白的表達(dá)Fig.5 The expressed protein identified by Western blot

3 討論

SLAM作為犬瘟熱病毒受體的鑒定有助于我們更好地理解該病毒感染的致病機(jī)理，特別是犬瘟熱病毒介導(dǎo)的免疫缺陷機(jī)理。SLAM受體是表達(dá)在淋巴細(xì)胞上的細(xì)胞膜糖蛋白，犬瘟熱病毒感染水貂后能與其特異性結(jié)合，支持犬瘟熱病毒復(fù)制，能引起細(xì)胞病變效應(yīng)［7］。SLAM結(jié)構(gòu)中的V結(jié)構(gòu)域?yàn)镃DV H蛋白識別并與之結(jié)合所必需的，其在傳遞來自抗原遞呈細(xì)胞提供的信息及調(diào)控免疫細(xì)胞分泌抗體和細(xì)胞因子方面起到重要作用［9］，但是，該結(jié)構(gòu)域中發(fā)揮受體功能的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)還需進(jìn)一步研究。本研究根據(jù)GenBank收錄的SLAM基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物，利用RT-PCR克隆到水貂SLAM基因編碼區(qū)，選用原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，該蛋白的獲得為SLAM受體與犬瘟熱病毒結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用研究奠定了基礎(chǔ)，從而為設(shè)計(jì)、開發(fā)病毒受體阻斷劑提供了理論依據(jù)。

pGEX-6p-1是一個高效表達(dá)載體，且該載體表達(dá)的GST融合蛋白可特異性結(jié)合GSH，為用GSTrap FF親和層析柱純化表達(dá)產(chǎn)物提供了方便［10］。因此，選用這一載體來表達(dá)融合蛋白。含重組質(zhì)粒的大腸埃希菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，其菌體蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳，在分子質(zhì)量63.2ku處出現(xiàn)大量蛋白，這與推算的融合蛋白的大小一致。用Western blot檢測GST融合蛋白，結(jié)果顯示該融合蛋白具有良好的抗原性。在今后的研究中，可進(jìn)一步應(yīng)用制備的SLAM蛋白免疫動物獲得高免血清，并采用免疫組化法對SLAM受體在水貂不同組織分布情況及與病毒載量的關(guān)系等進(jìn)行深入研究。

［1］ Kameo Y，Nagao Y，Nishio Y，et al.Epizootic canine distemper virus infection among wild mammals［J］.Vet Microbiol，2012，154（3-4）：222-229.

［2］ Goodrich J M，Quigley K S，Lewis J C，et al.Serosurvey of free-ranging Amur tigers in the Russian Far East［J］.J Wildl Dis，2012，48（1）：186-189.

［3］ McCarthy A J，Shaw M A，Goodman S J.Pathogen evolution and disease emergence in carnivores［J］.Proc Biol Sci，2007，274（1629）：3165-3174.

［4］ Tatsuo H，Ono N，Tanka K，et al.SLAM（CDwl50）is a cellular receptor for measles virus［J］.Nature，2000，406：893-897.

［5］ Tatsuo H，Ono N，Yanagi Y.Morbilliviruses use signaling lymphocyte activation molecules（CDl50）as cellular receptors［J］.J Virol，2001，75：5842-5850.

［6］ Tatsuo H，Yanagi Y.The morbillivirus receptor SLAM （CDl50）［J］.Microbiol Immunol，2002，46（3）：135-142.

［7］ Ostrakhovitch E A，Li S S.The role of SLAM family receptors in immune cell signaling［J］.Biochem Cell Biol，2006，84（6）：832-843.

［8］ 趙建軍，張海玲，高 晗，等.狐、貉和水貂犬瘟熱病毒受體SLAM的基因克隆及其真核表達(dá)［J］.獸類學(xué)報，2010，30（1）：79-86.

［9］ 劉 鑫.麻疹病毒通過受體SLAM對昆蟲細(xì)胞的感染及其誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究［D］.湖北武漢：武漢大學(xué)，2005.

［10］ 顧小雪，李玉峰，姜 平，等.豬生殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白抗原表位基因的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的抗原性［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2007，37（12）：1053-1057.