呼秀峰 姚 俊 馮笑山* 茹 藝 劉 剛

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

賁門癌組織中Midkine蛋白的表達(dá)及其臨床意義

呼秀峰 姚 俊 馮笑山* 茹 藝 劉 剛

（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，河南 洛陽(yáng) 471003）

目的 檢測(cè)賁門癌組織中 Midkine 蛋白表達(dá)情況，探討 Midkine 蛋白與賁門癌生物學(xué)行為的關(guān)系及意義。方法 采用免疫組織化學(xué)SP 法檢測(cè) Midkine 蛋白在正常賁門黏膜、賁門不典型增生組織、賁門癌組織中的表達(dá)情況，將檢測(cè)結(jié)果與賁門癌臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并對(duì)所有病例進(jìn)行隨訪，探討其與賁門癌預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 Midkine 蛋白在賁門癌中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)率（76.4%）顯著高于賁門不典型增生組織（26.9%）及正常賁門黏膜（5%），其表達(dá)強(qiáng)度與患者年齡、性別、腫塊大小、組織分化程度無(wú)關(guān)（P ＞ 0.05），而與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。結(jié)論 Midkine 蛋白高表達(dá)顯示賁門癌惡性程度高、分期晚、預(yù)后不良 ; Midkine 蛋白在賁門癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

賁門腫瘤；Midkine 蛋白；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

賁門腺癌（Gastric cardiac adenocinoma GCA）是上端胃臨近食管部位發(fā)生的腺癌，流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一[1]。近年來(lái)賁門癌的診斷及治療方面取得較大進(jìn)展，但由于缺乏敏感、特異的早期診斷指標(biāo)，所以賁門癌仍是預(yù)后差，病死率相當(dāng)高的惡性腫瘤之一。Midkine蛋白（MK）是一種肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子，通過(guò)促細(xì)胞增殖及血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抗凋亡等功能影響惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、分化凋亡，與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，Midkine蛋白在肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等許多惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并與腫瘤浸潤(rùn)及預(yù)后密切相關(guān)[2]，但MK在賁門癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用免疫組織化學(xué)方法（SP法）對(duì)賁門癌組織中Midkine蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分析其在賁門癌中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系，探討其在賁門癌發(fā)生發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

72例賁門癌均取自2007年～2009年河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷明確的存檔蠟塊。其中賁門癌組織72例，男56例，女16例，平均年齡（55.4±7.56）歲。癌旁不典型增生組織26例，男17例，女9例，平均年齡（54.2±7.9）歲。距癌組織10cm以上癌旁正常組織40例，男28例，女12例，平均年齡（55.3±8.3）歲。患者術(shù)前均未接受放療和化療。

1.2 主要試劑

兔抗人Midkine蛋白多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司，抗兔及抗鼠SP超敏試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.3 方法

將原石蠟包埋的蠟塊作4μm切片，每例作連續(xù)切片5張，分別作HE染色、Midkine蛋白和syndecan-1免疫組織化學(xué)SP法染色，2片備用。各組織切片常規(guī)脫蠟及水化后，依次按說(shuō)明書(shū)完成免疫組化染色各步驟。用已知陽(yáng)性對(duì)照片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷

陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：Midkine蛋白陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。凡細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜出現(xiàn)清晰的棕黃色染色的細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞。先在低倍鏡下觀察，隨機(jī)讀取5個(gè)高倍視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。并將陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)分為四個(gè)等級(jí)，分別為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分，≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。并將著色強(qiáng)度分為三個(gè)等級(jí)分別為：無(wú)色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。最后將兩項(xiàng)評(píng)分相乘，得出結(jié)果并分為四個(gè)等級(jí)：0分為陰性（-），1～2分為弱陽(yáng)性（+），3～4分為中度陽(yáng)性（++），大于4分則為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包作統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，生存分析應(yīng)用單變量Log-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 MK的表達(dá)

MK在正常賁門黏膜組織中多呈陰性表達(dá)，少部分為弱陽(yáng)性，陽(yáng)性率為5.0%。MK在賁門癌組織中的表達(dá)呈細(xì)胞漿或膜分布，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒，陽(yáng)性率為76.4%（55/72），顯著高于在賁門不典型增生組織及賁門正常組織中的表達(dá)，三者相比結(jié)果具有明顯差異（P＜0.01）（表1）。

表1 不同賁門黏膜組織中Midkine蛋白的表達(dá)

2.2 Midkine蛋白表達(dá)與賁門癌臨床病理學(xué)特征關(guān)系

72例賁門癌中MK的陽(yáng)性表達(dá)表達(dá)率為76.4%。MK的表達(dá)與TNM分期（χ2=12.231，P＜0.05）、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=8.50，P＜0.05）及漿膜浸潤(rùn)（χ2=5.073，P＜0.01）顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其表達(dá)與患者年齡、性別、腫塊大小、組織分化程度無(wú)關(guān)（P＞0.05）（表2）。

2.3 賁門癌組織中Midkine蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

本組患者隨訪時(shí)間為48個(gè)月，72例賁門癌患者中，Midkine蛋白陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存時(shí)間為27.0個(gè)月，3年生存率為37.5%。Midkine蛋白陰性表達(dá)組的中位生存時(shí)間及3年生存率均高于Midkine蛋白陽(yáng)性表達(dá)組（P=0.029）。經(jīng)檢驗(yàn)Midkine蛋白與患者預(yù)后相關(guān)，即Midkine蛋白陰性患者總體生存期長(zhǎng)，見(jiàn)。

3 討 論

表2 Midkine蛋白表達(dá)與GCA臨床病理學(xué)特征關(guān)系

賁門癌是一種在胃賁門部發(fā)生的惡性腫瘤，是我國(guó)北方地區(qū)常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一[3]。在西方國(guó)家，隨著遠(yuǎn)側(cè)部胃癌發(fā)病率的逐年下降[4，5]，賁門腺癌的發(fā)病率已接近全部胃癌的50%[6]。流行病學(xué)和人群研究提示，賁門癌的誘發(fā)因素、病理特征、以及臨床特征與胃遠(yuǎn)側(cè)部位腫瘤明顯不同[7]。腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制很復(fù)雜，是多階段、多步驟、多因素、多基因的發(fā)展過(guò)程，近年來(lái)雖然賁門癌在診斷與綜合治療方面取得較大進(jìn)展，腫瘤切除率和生存率有所提高，但由于早期癥狀不典型，加之缺乏敏感、特異的早期診斷指標(biāo)，大多數(shù)患者就診時(shí)已為中晚期，綜合治療后的五年生存率不超過(guò)24%[8]，因此深入研究賁門癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)于診斷及制定合理治療方案，具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。

Midkine蛋白（MK）即肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子。1988年，Kadomatsu等人通過(guò)差異雜交方法在小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞（HM-1）中發(fā)現(xiàn)的一種新基因，并報(bào)道其在胚胎性癌細(xì)胞分化早期強(qiáng)烈表達(dá)[9]。人類MK基因（MDK）定位于11P11.2上，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。其編碼蛋白質(zhì)分子量為13-kDa，富含堿性氨基酸和半胱氨酸[10]。目前已發(fā)現(xiàn)的MK受體包括syndecan家族成員、蛋白多糖受體型酪氨酸激酶、低密度脂蛋白（LDL）、受體相關(guān)的蛋白（LRP）以及間變性淋巴瘤激酶（ALK）等[11]。研究顯示MK具有多種生物學(xué)功能，與多種疾病的發(fā)病有關(guān)，然而MK最引人注目的特點(diǎn)是其在癌癥晚期頻繁并且強(qiáng)烈表達(dá)[2]。MK在癌變過(guò)程中顯示腫瘤的相關(guān)活性，包括轉(zhuǎn)化、纖維蛋白溶解、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞存活、抗凋亡等作用，但是到目前為止，MK促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的確切的作用機(jī)制尚不清楚[12]。研究顯示MK在許多惡性腫瘤如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、wilms瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤及硬脊膜瘤中高頻率、高強(qiáng)度表達(dá)，并與腫瘤發(fā)展進(jìn)程及嚴(yán)重程度密切相關(guān)[13]。Obata等[14]報(bào)道，胃賁門癌患者血清中MK含量顯著提高，而且晚期癌的血清MK含量高于早期瘤。趙志國(guó)等[15]報(bào)道胃賁門癌組織中MK表達(dá)陽(yáng)性率達(dá)76.6%，其表達(dá)水平與胃賁門癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及微血管密度密切相關(guān)，與患者年齡、腫瘤的大小、性別，胃賁門癌分化程度無(wú)關(guān)，患者血清中MK水平亦明顯高于正常人。然而，MK在賁門癌中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示，在72例賁門癌患者中有55例Midkine蛋白過(guò)度表達(dá)，陽(yáng)性率為76.4%。賁門癌組織中Midkine蛋白的陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（χ2=52.437，P＜0.01），與文獻(xiàn)報(bào)告的胃癌Midkine蛋白表達(dá)率一般在65%～80%相仿，（III+Ⅳ）期賁門癌組織中MK陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于（I+II）期（χ2=12.630，P＜0.05），有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MK陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（χ2=8.5，P＜0.05）。有漿膜浸潤(rùn)組MK陽(yáng)性表達(dá)率高于無(wú)漿膜浸潤(rùn)組（χ2=5.073，P＜0.01）。結(jié)果顯示Midkine蛋白過(guò)表達(dá)患者往往分期較晚，預(yù)后較差，提示Midkine蛋白可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。研究未能發(fā)現(xiàn)MK表達(dá)與年齡、性別及腫瘤細(xì)胞分化程度的相關(guān)性。

由于MK受體種類繁多，多種受體可能單獨(dú)或聯(lián)合調(diào)節(jié)MK生物活性，這些受體之間的相互作用及復(fù)合物組成的詳細(xì)情況尚未見(jiàn)確切報(bào)道，所以目前還不清楚它們之間通過(guò)怎樣的機(jī)制相互作用，值得我們進(jìn)一步研究。綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為MK可能與胃賁門癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并能反映出胃賁門癌組織的惡性程度及侵襲能力，提示可作為胃賁門癌早期診斷及預(yù)后分析的指標(biāo)之一，在臨床診斷及指導(dǎo)術(shù)后治療方面有一定價(jià)值。

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R735.2

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：1671-8194（2013）10-0083-03

洛陽(yáng)市新技術(shù)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：NO.1002238B）

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