胡繼紅，趙學(xué)凌，李宏昆，吳雪梅，王兵

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）指血液在深靜脈內(nèi)異常凝集。隨著預(yù)防和治療方法的發(fā)展，其發(fā)生率已明顯下降，但對(duì)于嚴(yán)重創(chuàng)傷或大手術(shù)后的老年患者，臥床或制動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)，下肢靜脈血流淤滯，易發(fā)生DVT而阻塞靜脈，嚴(yán)重者可發(fā)生下肢股青腫、缺血壞死，若血栓脫落，可導(dǎo)致大面積肺栓塞（pulmonary embolism，PE）而危及生命，慢性期常伴發(fā)DVT后綜合征［1］。因此，DVT的早期預(yù)測(cè)診斷和預(yù)防顯得非常重要，但對(duì)于血栓形成早期，靜脈內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)控、白細(xì)胞和血小板功能變化、誘導(dǎo)凝血/抗凝、纖溶/抗纖系統(tǒng)失衡及促進(jìn)血栓形成的機(jī)制尚不完全清楚，目前仍未發(fā)現(xiàn)較可靠的預(yù)診標(biāo)志物［2-3］。本研究擬檢測(cè)白細(xì)胞聚集、血小板活化相關(guān)基因轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1、纖溶酶原激活物抑制因子1（Serpine1）、血管性血友病因子（vWF）、血小板第4因子（PF4）在DVT患者血液中的表達(dá)變化，為探尋預(yù)診標(biāo)志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組

選取下肢靜脈曲張患者58例為DVT觀察對(duì)象，其中10例患者術(shù)前發(fā)生股靜脈血栓者納入血栓形成組，行抗凝加溶栓規(guī)范治療，待血栓消退，深靜脈血流通暢，能保證肢體靜脈回流后，再行淺靜脈抽剝術(shù)，48例術(shù)前未發(fā)現(xiàn)深靜脈血栓者均行淺靜脈抽剝術(shù)，術(shù)后5例發(fā)生DVT，亦納入血栓形成組，故血栓形成組共納入15例患者。43例未發(fā)生DVT者，隨機(jī)選取15例納入無血栓形成組。另選15名健康志愿者作為正常對(duì)照組。

DVT觀察、診斷考慮以下幾個(gè)方面及要點(diǎn)：由一組高年資醫(yī)生實(shí)施，系統(tǒng)掌握深靜脈血栓相關(guān)理論；能夠準(zhǔn)確動(dòng)態(tài)觀察癥狀變化及進(jìn)行正確的體格檢查；掌握相關(guān)手術(shù)技術(shù)，能保證手術(shù)質(zhì)量；結(jié)合相應(yīng)情況及時(shí)行超聲檢查，篩查有無血栓形成；必要時(shí)再行靜脈造影確診，確保所采集到的血液樣本與相應(yīng)狀態(tài)盡可能相符。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集、保存和總RAN的提取確保所采集血液樣本與相應(yīng)狀態(tài)盡可能相符，按不同組別采血，每例研究對(duì)象在相應(yīng)狀態(tài)，每次從肘靜脈采集靜脈血10 ml（真空枸櫞酸鈉抗凝抽血管，每管約2.7 ml），立即顛倒混勻20次以便充分混勻，避免血液部分凝固、血栓形成。采用血液樣本保存試劑盒（PAXgene Blood RNA Tube，BRT，美國(guó)QIAGEN公司）保存樣本，并于30 min內(nèi)將血樣（2.5 ml）倒入BRT管中，立刻蓋上蓋顛倒20次充分混勻血樣。然后，將BRT管置室溫（18～25℃）靜置2 h以上（但不超過24 h），以便血樣與BRT管中試劑充分反應(yīng)，達(dá)到最佳RNA提取效率。采用血白細(xì)胞和血小板中總RNA提取試劑盒（PAXgene Blood RNA Kit，美國(guó)QIAGEN公司）提取血白細(xì)胞和血小板中總RAN約45μl，具體操作按說明書進(jìn)行。從每份RNA樣本中取5μl按1∶200稀釋，檢測(cè)吸光度260/280（A260/A280）比值均在1.8～2.0。

1.2.2 cDNA合成取8μl RNA模板，加入實(shí)時(shí)-PCR反應(yīng)體系，低溫（4℃）離心15 s（3 000 g）后放入PCR儀，實(shí)時(shí)-PCR反應(yīng)條件為37℃60 min，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA（Quantscript RT kit Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，天根生化科技公司）。從每份cDNA中取出0.5μl為模板，行PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因GAPDH，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，條帶較亮、大小正確，然后將剩余的cDNA模板（約19μl）置于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR和實(shí)時(shí)-PCR引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)采用Primer 5.0軟件，要求必須跨越內(nèi)含子，避免基因組污染，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 人TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4基因引物序列

1.2.4 PCR檢 測(cè)TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表達(dá)采用PCR試劑盒（2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技公司）檢測(cè)血白細(xì)胞和血小板中TGFβ1、Serpine1、vWF、PF4表達(dá)。將血液0.5μl cDNA模板，加入RCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，3 min；擴(kuò)增條件：變性95℃30 s，退火60°30 s，72℃，延伸30 s，循環(huán)35次；72℃，10 min充分延伸。

1.2.5 實(shí)時(shí)-PCR檢測(cè)TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表達(dá)采用熒光實(shí)時(shí)-PCR試劑盒（Platinum?SYBR?Green qPCR試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司）檢測(cè)血白細(xì)胞和血小板中TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表達(dá)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀7300（美國(guó)ABI公司）和Power SYBR?Green實(shí)時(shí)-PCR Master Mix進(jìn)行實(shí)時(shí)-PCR，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，設(shè)定擴(kuò)增程序如下：預(yù)變性95℃2 min；變性95℃5 s，退火60℃30 s，循環(huán)40次。溶解曲線階段：變性95℃15 s；退火60℃30 s；延伸72℃30 s。以GAPDH作為內(nèi)參照。TGF-β1等目的基因的相對(duì)表達(dá)量按公 式2-△△CT=2［CtN（T-gene）-CtN（GAPDH）］-［CtA（T-gene）-CtA（GAPDH）］計(jì)算［4］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

重復(fù)檢測(cè)3次，用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析（q檢驗(yàn)）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各組中的表達(dá)

從凝膠電泳結(jié)果可見，血栓形成組中所檢測(cè)TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 RNA條帶灰度值明顯較正常對(duì)照組及無血栓形成組增高，提示TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4在血栓形成組表達(dá)明顯增高。

2.2 各組PCR電泳結(jié)果A值分析

TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4的A值在血栓形成組中明顯高于正常對(duì)照組和無血栓形成組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表2），提示TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4在血栓形成組表達(dá)升高。

表2 TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各組中的表達(dá)

2.3 實(shí)時(shí)-PCR檢測(cè)TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各組中的表達(dá)

TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在血栓形成組中的表達(dá)明顯高于無血栓形成組和正常對(duì)照組（P＜0.05），后兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3、4；圖2～3）。

表3 TGF-β1和Serpine1在各組間的相對(duì)表達(dá)量

表4 vWF和PF4在各組間的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

DVT形成過程是動(dòng)態(tài)變化過程，涉及多系統(tǒng)、多因素，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。參與DVT形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞、血白細(xì)胞、血小板、粘附因子、炎癥因子、血流動(dòng)力學(xué)等因素彼此相互影響，錯(cuò)綜復(fù)雜，凝血/抗凝、纖溶/抗纖溶系統(tǒng)生理狀態(tài)下保持動(dòng)態(tài)穩(wěn)定并相互制約，一旦平衡打破，在分泌的各種細(xì)胞因子調(diào)控下，內(nèi)皮細(xì)胞、血白細(xì)胞、血小板之間相互粘附、聚集，啟動(dòng)凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使局部分子微環(huán)境向血栓形成方向發(fā)展，致血栓形成［3］。其中TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4對(duì)白細(xì)胞粘附聚集、血小板活化具有重要調(diào)控作用。本研究探討它們?cè)贒VT患者血白細(xì)胞和血小板中表達(dá)變化及在血栓形成中的作用。

vWF主要在內(nèi)皮細(xì)胞和巨核細(xì)胞內(nèi)合成，在血小板α顆粒、血漿和內(nèi)皮下連接組織也能產(chǎn)生。vWF能與血小板糖蛋白Ⅰb-Ⅸ和內(nèi)皮下膠原結(jié)合，成為血小板粘附在內(nèi)皮下的橋梁，橋接血小板與靜脈內(nèi)皮間的粘附；還能與血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa結(jié)合，橋接血小板與血小板間的粘附，誘導(dǎo)血小板聚集，參與血栓形成。最近的研究發(fā)現(xiàn)，vWF水平增加與動(dòng)脈粥樣硬化、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、心肌梗死的發(fā)生密切相關(guān)［5-6］，但在DVT中的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)vWF mRNA在DVT患者血白細(xì)胞和血小板中表達(dá)上調(diào)，可能通過誘導(dǎo)血小板粘附、聚集，促進(jìn)了DVT形成。

血小板α顆粒中25%的蛋白質(zhì)是PF4，它是血小板活化后釋放最多的蛋白，被認(rèn)為是血小板活化的標(biāo)志物，活化的血小板可以分泌PF4，并誘導(dǎo)CD40L釋放，通過CD40-CD40L結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與血小板間的相互粘附，進(jìn)而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞從靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)。PF4可通過上調(diào)TLR2表達(dá)激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子（ICAM-1、E-slectin、VCAM-1）、趨化因子（MCP-1、MIP-1）和炎性因子（TNF、IL-1）促進(jìn)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而通過趨化因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞募集、粘附于靜脈壁內(nèi)皮，通過E-selectin/ESG-L介導(dǎo)血小板與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附作用，進(jìn)而促進(jìn)血栓形成及動(dòng)脈粥樣硬化［7-8］，但在DVT形成中的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)PF4 mRNA在DVT患者血白細(xì)胞和血小板中表達(dá)上調(diào)，可能通過介導(dǎo)白細(xì)胞粘附和血小板活化，促進(jìn)了血栓形成。

纖溶系統(tǒng)由纖維蛋白溶解酶（纖溶酶），纖溶酶激活物和纖溶酶抑制物組成。纖溶抑制物包括纖溶酶原激活抑制劑（PAI）、α2抗纖溶酶（α2-AP）和凝血酶激活的纖溶抑制物（TAFI）。Serpine1也稱纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1），主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞合成，近來發(fā)現(xiàn)血小板也能合成和儲(chǔ)存PAI-1，且當(dāng)血小板活化后可以釋放PAI-1，它通過抑制u-PA和t-PA的活性，阻斷或減緩纖溶酶原活化為纖溶酶，抑制血栓降解，促進(jìn)穩(wěn)定血栓的形成［9］。近來發(fā)現(xiàn)，血清PAI-1升高所導(dǎo)致的低纖溶能力，可能是DVT的高危因素之一且Serpine1基因4G/5G的多肽性與DVT發(fā)生密切相關(guān)［10-11］。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DVT模型大鼠股靜脈內(nèi)皮組織中Serpine1表達(dá)水平明顯上調(diào)［12］。本研究發(fā)現(xiàn)Serpine1 mRNA在DVT患者血白細(xì)胞和血小板中表達(dá)明顯上調(diào)，可能通過抑制纖溶而促進(jìn)了血栓形成。Serpine1在不同組織中的產(chǎn)生和釋放受到多種刺激因素，如內(nèi)毒素、炎癥因子（IL-1等）、TGF-β家族、TNF所調(diào)節(jié)。

其中，TGF-β家族重要成員TGF-β1可刺激血管平滑肌細(xì)胞分泌PAI-1［13］。TGF-β可以通過調(diào)控一些相關(guān)基因的表達(dá)，參與高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心肌肥厚及纖維化等心腦血管疾病的病理進(jìn)程。但在DVT中的作用研究較少，而本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1及其下游基因Serpine1、vWF、PF4 mRNA在DVT患者血白細(xì)胞和血小板中表達(dá)上調(diào)，TGFβ1可能通過調(diào)控下游基因Serpine1、vWF、PF4表達(dá)，參與白細(xì)胞粘附、血小板活化而促進(jìn)血栓形成。

［1］顧建平，徐克，滕皋軍.下肢深靜脈血栓形成介入治療規(guī)范的專家共識(shí)［J］.介入放射學(xué)雜志，2011，20：505-510.

［2］李炯，唐博.靜脈血栓栓塞生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2012，41：2326-2328.

［3］Esmon CT.Basic mechanisms and pathogenesis of venous thrombosis［J］.Blood Rev，2009，23：225-229.

［4］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nat Protoc，2008，3：1101-1108.

［5］Xu AG，Xu RM，Lu CQ，et al.Correlation of von willebrand factor gene polymorphism and coronary heart disease［J］.Mol Med Report，2012，6：1107-1110.

［6］van Galen KP，Tuinenburg A，Smeets EM，et al.Von willebrand factor deficiency and atherosclerosis［J］.Blood Rev，2012，26：189-196.

［7］Aidoudi S，Bikfalvi A.Interaction of PF4（CXCL4）with the vasculature：a role in atherosclerosis and angiogenesis［J］.Thromb Haemost，2010，104：941-948.

［8］Kowalska MA，Rauova L，Poncz M.Role of the platelet chemokine platelet factor 4（PF4）in hemostasis and thrombosis［J］.Thromb Res，2010，125：292-296.

［9］Brogren H，Karlsson L，Andersson M，et al.Platelets synthesize large amounts of active plasminogen activator inhibitor 1［J］.Blood，2004，104：3943-3948.

［10］Meltzer ME，Lisman T，de Groot PG，et al.Venous thrombosis risk associated with plasma hypofibrinolysis is explained by elevated plasma levels of TAFI and PAI-1［J］.Blood，2010，116：113-121.

［11］Akhter MS，Biswas A，Ranjan R，et al.Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）gene 4G/5G promoter polymorphism is seen in higher frequency in the Indian patients with deep vein thrombosis［J］.Clin Appl Thromb Hemost，2010，16：184-188.

［12］胡繼紅，吳雪梅，李興國(guó)，等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和纖溶酶原激活物抑制因子1促進(jìn)創(chuàng)傷性深靜脈血栓形成的實(shí)驗(yàn)研究［J］.介入放射學(xué)雜志，2011，20：890-894.

［13］Samarakoon R，Higgins SP，Higgins CE，et al.TGF-beta1-induced plasminogen activator inhibitor-1 expression in vascular smooth muscle cells requires pp60（c-src）/EGFR（Y845）and Rho/ROCK signaling［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44：527-538.