郝 林姜 波韓從輝龐 慧何厚光付 昱張俊杰張培影*

（1 徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2 徐州市中心醫(yī)院中心實驗室，江蘇 徐州 221009）

苦瓜MAP30基因克隆與鑒定

郝 林1姜 波1韓從輝1龐 慧2何厚光1付 昱2張俊杰1張培影1*

（1 徐州市中心醫(yī)院泌尿外科，江蘇 徐州 221009；2 徐州市中心醫(yī)院中心實驗室，江蘇 徐州 221009）

目的 克隆苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白 MAP30 全長基因并構建其表達載體。方法 提取苦瓜的基因組 DNA，根據 Genebank 中已公開發(fā)表的 MAP30 序列，設計出一對特異性引物。采用 PCR 技術，從苦瓜的基因組 DNA 中獲得 MAP30 全長序列共 860bp，克隆入 pET-28a （+）載體中，進行酶切及測序鑒定。結果 克隆了 MAP30 全長基因，經測序證實與 Genbank 中收錄的 SEA 基因序列同源性達 100%。結論 本研究成功地克隆了 MAP30 全長基因，為進一步研究 MAP30 基因的靶向抗腫瘤研究奠定了基礎。

苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白；載體構建；序列分析

苦瓜（Momordica charantia，MC）為葫蘆科苦瓜屬植物，是一種藥食同源的植物，其根、莖、葉、花、果實、種子皆可入藥。具有清熱解毒、降低血糖、抗突變、抗HIV、抗腫瘤、抗生育、抗菌、免疫調節(jié)等作用?？喙系幕钚猿煞址N類繁多，包括苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白（MAP30）、三萜類、生物堿類、甾類化合物、糖類、有機酸類及微量元素等。MAP30是苦瓜中相對分子質量為30000的抗獲得性免疫缺陷綜合征病毒的蛋白質，它屬于單鏈I型核糖體失活蛋白（ ribosome inhibiting protein，RIP）家族[1]，此類蛋白普遍存在于高等植物中，因可使真核細胞核糖體失活而得名，它具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性。由于MAP30抗腫瘤活性強、毒性低，已成為近年抗癌藥物研究的熱點。本研究克隆苦瓜Ⅰ型核糖體失活蛋白（MAP30）全長基因，為進一步研究MAP30基因片段在抗腫瘤中的作用提供了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

幼嫩苦瓜1個，大腸埃希菌DH5a和質粒pET-28a（+）為Sangon公司產品。T4DNA連接酶，Taq DNA聚合酶，限制性內切酶BamH I、Xho I均購自Takara公司，質粒小量提取試劑盒購自Invitrogen公司，其余試劑均為分析純。

1.2 苦瓜MAP30基因的擴增

①引物設計：根據NCBI上的序列設計擴增引物：Forward：5’-CGGGATCCATGGTGAAATGCTTACTAC-3’；Reverse：5’-CC GCTCGAGATTCACAACAGATTCC-3’，其中紅色部分分別為限制性內切酶BamH I、Xho I酶切位點序列。②模板制備：刮取幼嫩苦瓜瓜皮，于液氮中研磨，按照植物基因組DNA提取試劑盒進行苦瓜基因組提取。③PCR擴增MAP30全長基因。④PCR產物回收：用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行分離，并用Axygen公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的基因片段。

以上述所得基因組為模板，以pF和pR為引物，擴增MAP30全長基因，反應體系如表1。

反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。

1.3 將目的基因連接到載體pET-28a （+）

表1 PCR擴增MAP30基因的反應體系

將MAP30目的基因的PCR產物與pET-28a （+）載體酶切產物進行連接，16℃反應過夜。轉化DH5a感受態(tài)細胞，涂氨芐抗性平板，37℃過夜培養(yǎng)，篩選克隆，反應體系如表2。

表2 PCR產物與pET-28a （+）的連接反應

1.4 重組質粒的酶切鑒定和序列測定

對重組質粒進行酶切鑒定，反應體系如表3。

表3 pET-28a （+）-MAP30酶切反應體系

37 ℃作用2h后1%瓊脂糖凝膠電泳分析，各選擇酶切鑒定正確的兩個克隆送Invitrogen公司測序。

2 結 果

苦瓜MAP30基因的克?。焊鶕﨨CBI GenBank上公布的MAP30全基因序列，在MAP30基因閱讀框起始與末尾設計引物，PCR擴增目的基因。目的基因片斷長度約為860bp，與理論值相符。

3 討 論

Ⅰ型核糖體失活蛋白（ribosome inhibiting protein，RIP）是一種強堿性單鏈蛋白質，主要富集在苦瓜種子、根、莖及葉中，具有抗腫瘤和抗病毒等生物學活性。此類蛋白的主要功能是N-RNA糖苷酶活性及切斷DNA超螺旋活性，故核糖體失活蛋白可能具有類SOD活性。研究表明，MAP30對許多腫瘤細胞有較強的抑制作用。Park等[7]發(fā)現MAP30對許多類型病毒感染的細胞、腫瘤細胞非常有效，而對未感染的人正常細胞，包括T2細胞、巨噬細胞、單核細胞以及非腫瘤患者的血、腎臟、肝臟、神經、精子細胞、皮膚細胞和胚胎細胞等均無毒性。

MAP30 抗腫瘤作用的機制可能的途徑包括：①抑制核糖體活性。MAP30為RIP，具有N-糖苷酶活性，能使游離核糖體28S rRNA的A4324或G4323脫去一個A，核糖體失去活性，抑制真核生物蛋白質合成，也能作用于DNA和RNA，使環(huán)狀DNA變?yōu)橥負?學 失 活 狀 態(tài)[8]； ② 誘 導 細 胞 凋 亡 。 熊 術 道 等[5]研 究 表 明 ， 苦 瓜 蛋白對K562細胞生長具明顯抑制作用，其機制主要通過下調Bcl-2基因表達，從而下調Bcl-2/Bax 比值來驅動細胞凋亡通路順利進行；Fan 等[9]在實驗中明顯觀察到MAP30導致細胞凋亡的形態(tài)學變化，Northern blots和Westernblots分析結果顯示，凋亡前期蛋白Bax 的轉錄和表達水平均隨之上調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的轉錄和表達水平則有所下調。首次證明了MAP30有誘導人大腸癌LoVo 細胞凋亡的重要作用。Sun等[10]利用基因芯片分析表明，MAP30通過上調與細胞凋亡直接相關的Bxa、Caspase-3和ARADD基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡。熊術道等[11]研究表明苦瓜蛋白可致粘附分子CD54表達上調，使細胞粘附性發(fā)生改變，從而導致腫瘤細胞凋亡；③下調腫瘤細胞增殖的相關基因。Sun等[10]利用基因芯片發(fā)現MAP30下調一些在腫瘤細胞的增殖和膨大中起作用的基因而抑制腫瘤細胞的生長。④抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）活性及表達而抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲；⑤調節(jié)白細胞介素-6（IL-6）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等細胞因子的表達水平[11]。

本實驗應用基因重組技術，以聚合酶鏈反應方法獲得了MAP30基因全長片段 ，通過酶切、純化、連接等重組方法，構建帶有目的基因片段的克隆載體pET-28a （+）-MAP30，為進一步研究MAP30基因在真核細胞中表達蛋白，并進一步研究其生物學活性奠定基礎。

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R394

：B

：1671-8194（2013）02-0057-02

中醫(yī)藥管理局項目資助（LZ11134）；徐州市科技計劃項目（XZZD1030）

*通訊作者：E-mail：zpying58@126.com