李彩霞 徐元品 鄒子宏 周曉鴻 (云南省昆明市延安醫(yī)院皮膚科，昆明 650051)

麻風(fēng)病是由麻風(fēng)分枝桿菌引起，主要累及皮膚和外周神經(jīng)，是導(dǎo)致人類畸殘的一種重要疾病。在與傳染性麻風(fēng)患者同等接觸的條件下，只有極個(gè)別人發(fā)病，夫妻間的發(fā)病率也僅為3% ～5%，這是因?yàn)槁轱L(fēng)病是一種與機(jī)體免疫力有關(guān)的疾病，大多數(shù)健康成人對(duì)麻風(fēng)桿菌有著自然的免疫力。目前對(duì)麻風(fēng)病的發(fā)生、發(fā)展及發(fā)生麻風(fēng)反應(yīng)的確切機(jī)制仍不清楚，但普遍認(rèn)為與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，尤其是細(xì)胞免疫在麻風(fēng)的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類特定亞群的CD4+T細(xì)胞，具有免疫調(diào)節(jié)作用，能通過(guò)抑制自身免疫細(xì)胞活化而發(fā)揮抑制作用。目前，關(guān)于麻風(fēng)患者外周血Treg的研究較少，為此，我們通過(guò)檢測(cè)麻風(fēng)病患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+/CD4+，以探討其在麻風(fēng)病發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)分組 治愈組:26例，來(lái)源于楚雄州雙柏縣麻風(fēng)村，均為已治愈的麻風(fēng)患者［1］。其中男18例，女8例，年齡46～82歲，平均(66．31～10．36)歲;病程 20～65年，平均(47．5±12．76)年;停藥15～54年，平均(40．12±12．06)年。

現(xiàn)癥組:51例，來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科門診、云南昆明市晉寧縣皮膚病防治站、昆明市西山區(qū)疾病預(yù)防控制中心及昆明市官渡區(qū)疾病預(yù)防控制中心。其中男38例，女13例，年齡21～68歲，平均(41±12．32)歲，病程 2～20個(gè)月，平均(31±30．49)個(gè)月;治療時(shí)間:1～52個(gè)月，平均(19．56 ±10．16)個(gè)月。

ENL組:5例，來(lái)源于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科門診，其中男4例，女1例，年齡26～38歲，平均33．2±5．45歲，病程1 ～6個(gè)月，平均(3±2)月;治療時(shí)間:1～6個(gè)月，平均(3±2)個(gè)月。

健康對(duì)照組:56例，為本院健康體檢人群，其中男31例，女 25例，年齡 25．12～36．25歲，平均(33．2±7．1)歲。血清學(xué)及肝腎功能檢查正常，排除感染結(jié)核、HBV、HCV、麻風(fēng)、HIV、患自身免疫系統(tǒng)疾病及腫瘤的人群。

1．2 主要儀器和試劑 熒光素標(biāo)記的抗體:PerCP標(biāo)記的抗人CD4抗體、FITC標(biāo)記的抗人CD25抗體、PE標(biāo)記的抗人Foxp3抗體及其同型對(duì)照FITC－mouse IgG1、PE－mouse IgG1、Human Foxp3 Buffer Set以及緩沖液 Stain Buffer(FBS)，購(gòu)自美國(guó) Becton－Dickinson(B－D)公司。人淋巴細(xì)胞分離液 MD－LS－077購(gòu)自天津美德太平洋科技有限公司。流式細(xì)胞儀為Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics XL型。

1．3 方法 取一流式試管，加入 FITC anti－h(huán)uman CD4/PE，anti－h(huán)uman CD25mAb/AF647，anti－h(huán)uman CD127各2μl，再加100μl新鮮肝素抗凝血，混勻，避光孵育20分鐘，然后加入1 ml溶血素溶血，避光放置5分鐘，以2 ml 1×PBS洗滌2次，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。用FCSExpressV3軟件分析和檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+Foxp3+T/CD4+的百分率。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS19．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組計(jì)量資料符合正態(tài)分布及方差齊性者，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析;如方差不齊，則采用t'檢驗(yàn)。多組計(jì)量資料間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LDS檢驗(yàn)，P＜0．05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 麻風(fēng)治愈組和現(xiàn)癥組的Treg比正常對(duì)照組高，并且治愈組的Treg又高于現(xiàn)癥組，而ENL組的Treg則低于正常對(duì)照組，見(jiàn)表1。

2.2 在現(xiàn)病癥病人中，少菌型及多菌型麻風(fēng)患者的Treg均高于正常對(duì)照組，并且少菌型患者的Treg高于多菌型患者(P＜0．05)，見(jiàn)表2。

表1 Treg在各組人群的百分比Tab．1 The proportion of Treg among each group

表2 現(xiàn)癥麻風(fēng)患者中少菌型(PB)及多菌型患者(MB)Treg的百分比Tab．2 The proportion of Treg among MB and PB leprosy

3 討論

目前普遍認(rèn)同麻風(fēng)病是一種與機(jī)體免疫功能有關(guān)的傳染病，其很多損害并不是由麻風(fēng)桿菌直接引起，而是由于該菌所誘發(fā)的宿主免疫應(yīng)答所致。自1995 年 Sakaguchi［1］首次報(bào)道 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(T regulatory cells，Treg)以來(lái)，該群細(xì)胞受到了廣泛的關(guān)注。Treg是體內(nèi)存在的一群具有免疫調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，具有免疫無(wú)反應(yīng)性和免疫抑制性兩大特征，在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)及免疫耐受方面起著重要作用。Foxp3即叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，是Treg細(xì)胞特異性的分子標(biāo)記，主要作用是抑制轉(zhuǎn)錄，決定了Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。其基因突變可引起類似于系統(tǒng)性自身免疫病的IPEX綜合征(X染色體性聯(lián)綜合癥)，表現(xiàn)為全面的免疫功能失調(diào)［2］。關(guān)于Treg的作用機(jī)制尚存爭(zhēng)議，目前認(rèn)為主要有以下幾種:細(xì)胞接觸依賴、分泌IL－10、IL－2、TGF－β等抑制性細(xì)胞因子，表達(dá)特異性轉(zhuǎn)錄因子等［3－9］。

本實(shí)驗(yàn)中，麻風(fēng)治愈組和現(xiàn)癥組的Treg均比正常對(duì)照組高，并且治愈組的Treg又高于現(xiàn)癥組，而ENL組的Treg則低于正常對(duì)照組。機(jī)體在麻風(fēng)桿菌的刺激下發(fā)生免疫應(yīng)答，促進(jìn)了Treg不同程度的分化與增殖，產(chǎn)生了較多的Treg，尤其對(duì)于現(xiàn)癥少菌型和已治愈的麻風(fēng)患者而言，Treg的數(shù)量增加更為明顯，這與Attia［10］報(bào)道的結(jié)果相一致。一方面，增多的Treg通過(guò)抑制T細(xì)胞的活化、增殖及抑制其效應(yīng)功能，使機(jī)體避免過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答對(duì)自身組織的損傷，對(duì)免疫功能起著一定的保護(hù)作用。另一方面，Treg對(duì)機(jī)體的免疫功能起著抑制作用，這將削弱機(jī)體的免疫功能，使機(jī)體罹患麻風(fēng)病的可能性增加。

對(duì)于已經(jīng)治愈的麻風(fēng)患者來(lái)說(shuō)，雖然臨床癥狀完全消失，連續(xù)細(xì)菌檢查為陰性，但Treg仍保持在較高水平，抑制了機(jī)體的免疫反應(yīng)，使治愈患者對(duì)麻風(fēng)桿菌仍然存在著易感性，這可能是導(dǎo)致麻風(fēng)病復(fù)發(fā)的原因之一，鄭碧忠［11］的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。

在麻風(fēng)病漫長(zhǎng)的病程中，由于機(jī)體免疫狀態(tài)的改變而突然發(fā)生病情活躍或加劇的現(xiàn)象，稱為麻風(fēng)反應(yīng)。結(jié)果表明，發(fā)生Ⅱ型麻風(fēng)反應(yīng)的患者(ENL組)，其Treg明顯低于正常對(duì)照組。這可能是由于麻風(fēng)患者機(jī)體的免疫力及微環(huán)境在不斷地發(fā)生變化，某些因素使Treg的數(shù)量急劇減少，導(dǎo)致機(jī)體的免疫狀態(tài)突然發(fā)生改變，從而引發(fā)了麻風(fēng)反應(yīng)。

總之，在以細(xì)胞免疫為主的麻風(fēng)免疫過(guò)程中，Treg不僅能抑制自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，而且還參與誘導(dǎo)免疫耐受及免疫調(diào)節(jié)，決定了免疫反應(yīng)的走向是激活免疫還是誘導(dǎo)耐受，對(duì)維持麻風(fēng)患者機(jī)體內(nèi)環(huán)境的自穩(wěn)狀態(tài)起著重要作用。隨著對(duì)Treg細(xì)胞研究的不斷深入，用Treg細(xì)胞為靶點(diǎn)的新型免疫調(diào)控治療策略已成為研究的熱點(diǎn)［12－18］。檢測(cè)Treg的數(shù)量是否有助于麻風(fēng)病的早期診斷?對(duì)麻風(fēng)患者Treg細(xì)胞數(shù)量與功能進(jìn)行調(diào)整是否有助于麻風(fēng)病的治療?增強(qiáng)麻風(fēng)易感人群T細(xì)胞的功能是否有助于預(yù)防麻風(fēng)菌感染或防止麻風(fēng)病復(fù)發(fā)?Treg是否通過(guò)某種信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)麻風(fēng)病的慢性過(guò)程?對(duì)于這些問(wèn)題還有待于進(jìn)一步深入研究。

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