張 沛 韓寶芹 陳列歡 彭燕飛 劉萬順 鄭漢東 楊 艷

(中國海洋大學海洋生命學院，青島266003)

殼寡糖(COS)是殼聚糖的降解產物，由2～10個氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。殼寡糖作為自然界中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，由于具有分子量低、水溶性好、易吸收等特性，在提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、促進傷口愈合等方面具有較好的生物學功能［1，2］。近年來，隨著研究的深入，殼寡糖在免疫方面的研究越來越多，殼寡糖對免疫系統(tǒng)存在著多元、多效性的調節(jié)功能［3］。研究表明殼寡糖能夠促進巨噬細胞的增殖和相關細胞因子的分泌，進而反饋激活巨噬細胞和其它免疫細胞，形成網絡狀的免疫調節(jié)體系，極大地增強機體的免疫功能，抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長和轉移［4，5］。殼寡糖對巨噬細胞的激活作用在殼寡糖的免疫調節(jié)、抑制腫瘤功能中發(fā)揮重要作用［6］。殼寡糖能夠促進巨噬細胞釋放一氧化氮，分泌多種細胞因子［7，8］，如殼寡糖能夠促進巨噬細胞中IL-18的基因轉錄和蛋白表達，刺激巨噬細胞分泌 TNF-α 和 IL-1β、IL-18和IL-6［5，9-11］。

殼寡糖對巨噬細胞的激活作用是通過巨噬細胞表面的受體介導的。但是對于殼寡糖與巨噬細胞相互作用的分子基礎仍存在不同的結論。Han等［12］通過激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)甘露糖受體能夠介導殼寡糖的內吞，認為殼寡糖誘導巨噬細胞釋放TNF-α和Ca2+內流的功能主要是通過甘露糖受體介導的。Feng等［10］發(fā)現(xiàn)甘露糖能夠抑制殼寡糖的內吞，而LPS和β-葡聚糖則不能抑制殼寡糖的內吞。Wu等［13］發(fā)現(xiàn)用TLR4、CD14和CR3的抗體處理巨噬細胞RAW264.7，能夠阻斷殼寡糖聯(lián)合干擾素誘導的一氧化氮的產生，表明殼寡糖能夠通過結合巨噬細胞表面的TLR4、CD14和CR3受體誘導NF-кB的激活和一氧化氮的產生。有關哪個受體在介導殼寡糖的內吞中發(fā)揮關鍵受體的作用，殼寡糖進入巨噬細胞進而激活巨噬細胞的分子量范圍是多少，目前還沒有明確的觀點，需要進一步深入研究。

本研究利用本實驗室分離的高活性殼聚糖酶，通過酶水解法制備主要成分為3-7單糖聚合度的殼寡糖，將殼寡糖進行熒光標記，用熒光顯微鏡技術觀察巨噬細胞對殼寡糖的內吞作用，進而從體外和體內兩方面評價COS的免疫調節(jié)功能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 脂多糖(LPS)(Sigma)，淀粉(國藥集團化學試劑有限公司)，D-Hank's液體(GEN-ray)，F(xiàn)ITC干粉(青島華晟新澤生物科技有限公司)，MTT干粉(青島華晟新澤生物科技有限公司)，中性紅(上海試劑三廠)，二甲基亞砜(DMSO)(南京化學試劑有限公司)，小牛血清(HyClone)，DMEM液體培養(yǎng)基(Solarbio Beijing Solarbio Science＆Technology Co.Ltd)，腫瘤壞死因子α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(北京愛迪博生物科技有限公司)，IgG、IgM酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海恒遠生物有限公司)，TLR4單克隆抗體(Cell Signaling)，高活性殼聚糖酶(本實驗室分離純化)。

SPF清潔級昆明種小白鼠購自青島市藥檢所。小鼠雌雄各半，實驗之前在本動物房喂養(yǎng)適應一周，給予充足的食物和水。

標準規(guī)格的酶標儀(RT-2100C，Rayto)，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱(HF240，HEAL FORCE)，超凈工作臺(HEAL FORCE)，倒置熒光顯微鏡(Nikon TS100)，細胞培養(yǎng)瓶(Costar公司)，96孔培養(yǎng)板(Costar公司)，6孔培養(yǎng)板(Costar公司)等。

1.2 殼寡糖的酶解制備 配置100 ml殼聚糖溶液(濃度1%，調節(jié)pH為5.5)，于45℃恒溫水浴鍋中保溫10分鐘，然后加入1 ml殼聚糖酶 A溶液(10%)，立即振搖開始反應，每隔10分鐘各取反應液0.5 ml加入2%NaOH溶液0.2 ml，混勻觀察殘存殼聚糖沉淀產生的狀況。當沒有沉淀產生時加入2%NaOH溶液10 ml終止反應。

1.3 殼寡糖成份的鑒定 采用高效液相色譜(HPLC)法分析殼聚糖酶水解產物的組成。高效液相色譜條件如下:使用Waters高效液相色譜儀，檢測器為301型蒸發(fā)光散色檢測器。樣品溶液濃度設置為1%，流動相為乙腈/水溶液(75∶25)，柱溫保持在 30℃。進樣量為 20 μl，流速 1.0 ml/min。

1.4 殼寡糖的熒光標記 殼寡糖的熒光標記參照賀繼東的方法進行［14］，并加以改進，具體方法如下:配制25 ml FITC-無水甲醇溶液(1 mg/ml)，10 ml殼寡糖-水溶液(15%，m/V)，調節(jié)殼寡糖溶液的pH值為9，加入FITC-甲醇溶液，混勻后室溫、避光反應3小時(殼寡糖與熒光素的質量比為60∶1)。反應結束后，使用乙醇沉淀法獲得產品FITC-COS，避光保存。

1.5 FITC-COS與巨噬細胞的相互作用研究 腹腔注射1%淀粉刺激小鼠3天后，脫頸處死，無菌條件下提取小鼠腹腔巨噬細胞，調整細胞密度為5×104個/ml，將細胞懸液接種至48孔板中，置5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，待細胞貼壁后吸出上清液，用D-Hank's液洗去未貼壁細胞，在每個孔中加入2 ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后，棄掉每個孔中的培養(yǎng)基，加入1 ml FITC-COS溶液(1 mg/ml)，孵育不同的時間(1、5、15分鐘)后，棄去FICT-COS溶液，每孔用PBS沖洗2遍，然后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

為了研究COS與TLR4受體的相互作用，按照上述實驗方法制備腹腔巨噬細胞，細胞在加入FITC-COS之前，在孔中加入TLR4單克隆抗體(稀釋比例為1∶10)，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1小時，然后棄去抗體，加入1 ml FITC-COS溶液(1 mg/ml)，孵育15分鐘后，棄去FICT-COS溶液，用PBS沖洗2遍后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.6 殼寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞(PMφ)功能的影響

1.6.1 MTT法測COS對小鼠PMφ增殖的影響小鼠腹腔注射1%淀粉刺激3天后，脫頸處死，無菌條件下提取小鼠腹腔巨噬細胞，調整細胞密度為5×104個/ml，接種于 96 孔板中，每孔 200 μl，置 5%CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，待細胞貼壁后吸出上清液，用D-Hank's液洗去未貼壁細胞。實驗設6組:對照組、LPS組(10 ng/ml)、不同濃度的COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設8 個平行孔。加藥后細胞繼續(xù)培養(yǎng)，在不同的時間段(24小時、48小時、72小時)進行MTT測定。

1.6.2 小鼠PMφ吞噬中性紅能力的測定 小鼠PMφ的制備同1.6.1。實驗分6組:對照組，LPS組(10 ng/ml)，不同濃度的 COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設8個平行孔。加藥后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入中性紅200 μl(0.7 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)1小時，棄去培養(yǎng)液，用預溫生理鹽水液洗滌3遍，用濾紙輕輕吸干液體。每孔加裂解液(0.1 mol/L的冰乙酸與無水乙醇按1∶1體積比混勻)200 μl，4℃過夜。以 D-Hank's液做空白，在492 nm測定光吸收值。

1.6.3 小鼠PMφ分泌TNF-α因子能力的測定 小鼠PMφ的制備同1.6.1。實驗分6組:對照組、LPS組(10 ng/ml)、不同濃度的 COS 組(10、20、50、100 μg/ml)，每組設8個平行孔。加藥后細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，收集每孔上清培養(yǎng)液，－20℃凍存，待用ELISA試劑盒測定上清中TNF-α含量。實驗操作按照試劑盒上步驟進行。

1.7 殼寡糖對小鼠體內免疫功能的影響 將實驗小鼠分為對照組、殼寡糖低劑量組(100 mg/kg體重)、中劑量組(250 mg/kg體重)和高劑量組(500 mg/kg體重)，每組小鼠雌雄各半。實驗組小鼠每天灌胃相應劑量的殼寡糖，對照組小鼠灌胃相應體積的生理鹽水，分別在相應的時間點(10、20天)，每組取8只小鼠，摘取小鼠眼球取血，離心(3 000 r/min，15分鐘)分離血清，－20℃凍存，待測血清中IgG、IgM的含量。小鼠脫頸處死，進行解剖，分離胸腺和脾臟組織，用濾紙吸干殘血后，并進行稱重(mg)，計算小鼠胸腺和脾臟指數(shù)。胸腺和脾臟指數(shù)定義為每10克小鼠體重含有的胸腺或脾臟重量(mg/10 g)。

1.8 統(tǒng)計學分析 實驗計量數(shù)據(jù)表示為x ± s，數(shù)據(jù)處理及分析用SPSS軟件進行，用t檢驗進行數(shù)據(jù)間差異顯著性分析，P＜0.05為差異顯著性水平。

2 結果

2.1 殼寡糖聚合度分析殼聚糖酶水解產物HPLC分析結果見圖1，從該圖中可以看出，該酶解產物主要含有聚合度3～7單糖為主的寡糖成分，只含有少量的殼8糖等成分。

圖1 殼聚糖酶水解產物HPLC分析結果Fig.1 HPLC result of enzyme hydrolysis product of chitosan

圖2 巨噬細胞對殼寡糖的內吞作用Fig.2 Phagocytosis of chito-oligosaccharides by macrophage

2.2 殼寡糖與巨噬細胞的相互作用 殼寡糖與巨噬細胞相互作用的研究結果見圖2，從圖中可以看出熒光標記的殼寡糖可以被巨噬細胞所吞噬而進入細胞內，且隨著時間的延長，巨噬細胞吞噬殼寡糖的數(shù)量不斷增加，F(xiàn)ITC-COS與巨噬細胞作用15分鐘后，大量的殼寡糖進入到巨噬細胞中。加入TLR4單克隆抗體對巨噬細胞預處理1小時后，再加入FITC-COS相互作用15分鐘，巨噬細胞對殼寡糖的吞噬被抑制，視野下找不到吞噬寡糖的巨噬細胞。

圖3 殼寡糖對小鼠PMφ體外增殖的影響Fig.3 Effects of COS on the proliferation ability of mice PMφ

圖4 不同濃度殼寡糖對小鼠巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響(24小時)Fig.4 Effect of COS on the neutral red phagocytosis ability of mice PMφ at different concentrations(24 h)

2.3 COS對小鼠PMφ增殖的影響 COS對小鼠原代培養(yǎng)的腹腔巨噬細胞增殖功能的影響見圖3。從圖中看出不同濃度的殼寡糖刺激小鼠腹腔巨噬細胞不同時間后，對其增殖均沒有顯著影響，即殼寡糖不能促進小鼠原代培養(yǎng)PMφ的體外增殖能力。

2.4 COS對小鼠PMφ吞噬中性紅能力的影響 殼寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響見圖4。由圖中可以看出，LPS能夠顯著增強巨噬細胞的吞噬能力，與對照組相比差異顯著。殼寡糖在不同濃度下(10～100 μg/ml)均能提高細胞吞噬中性紅的能力，其中濃度為20 μg/ml時作用效果最佳。

圖5 不同濃度殼寡糖對小鼠PMφ分泌TNF-α能力的影響(24小時)Fig.5 Effect of COS on TNF-α secretion ability of mice PMφ at different concentrations(24 h)

2.5 COS對小鼠PMφ分泌TNF-α能力的影響殼寡糖對小鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子TNF-α能力的影響見圖5。由圖中可以看出，LPS能誘導巨噬細胞合成并分泌TNF-α，與對照組相比差異顯著。殼寡糖在實驗濃度范圍內能夠刺激小鼠PMφ分泌TNF-α因子，在20 μg/ml時作用效果最佳。當殼寡糖濃度升高到50 μg/ml或者更高時，殼寡糖對小鼠PMφ分泌TNF-α因子的作用反而下降。

2.6 殼寡糖對小鼠血清IgG、IgM含量的影響 小鼠灌胃COS 10天和20天后，對小鼠血清中IgG、IgM含量影響的結果見圖6。測定結果表明殼寡糖在提高小鼠免疫球蛋白合成方面有較明顯的效果，通過增加體內免疫球蛋白的含量，有助于增強機體免疫力。

對比兩個時間段的實驗結果，可以看出隨著時間的延長，高劑量組小鼠體內的免疫球蛋白G(IgG)的含量有明顯的提高，與對照組相比差異顯著，顯示出500 μg/kg體重的殼寡糖能夠有效增強小鼠的免疫功能。小鼠灌胃殼寡糖對血清中免疫球蛋白M(IgM)含量沒有顯著影響。

圖6 不同劑量殼寡糖對小鼠血清中IgG和IgM含量的影響(10、20天)Fig.6 Effect of different doses of COS on mice serum IgG and IgM content(10，20 d)

圖7 不同劑量殼寡糖對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(10、20 天)Fig.7 Effect of different doses of COS onmice thymus and spleen index(10，20 d)

2.7 殼寡糖對小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響 小鼠灌胃COS 10天和20天后，對小鼠脾臟、胸腺指數(shù)影響的結果見圖7。測定結果表明小鼠灌胃殼寡糖能夠顯著增加小鼠脾臟指數(shù)，與對照組相比差異顯著。但是，小鼠灌胃殼寡糖對胸腺指數(shù)的影響并不顯著。

3 討論

近年來，隨著研究的深入，殼寡糖因其特有的分子量小、水溶性好、易吸收等性質，表現(xiàn)出更好的生理學功能。殼寡糖在調節(jié)機體免疫功能方面的研究越來越多。但是對于殼聚糖的有效降解，對于殼寡糖與巨噬細胞相互作用的分子基礎，以及殼寡糖激活巨噬細胞后誘導的細胞內信號轉導途徑，殼寡糖誘導巨噬細胞合成細胞因子的機制等問題還有待于進一步深入研究。

本研究利用本課題組分離得到的高活性殼聚糖酶，通過酶水解的方法制備殼寡糖。該殼聚糖酶活性高，且水解產物以3～7單糖聚合度的寡糖為主要成分，殼聚糖酶水解速度快，降解產物至3～7單糖聚合度時，酶對底物不再降解。而傳統(tǒng)的酸、堿降解法制備殼寡糖，降解過程難以控制，產物主要是單糖，難以制備高活性的寡糖成分。該殼聚糖酶降解法是一種快速，可控，環(huán)境無污染的理想制備方法。

殼寡糖對巨噬細胞的激活作用是通過巨噬細胞表面的受體介導的。但是對于殼寡糖與巨噬細胞相互作用的分子基礎仍存在不同的結論。前期研究報道，甘露糖受體、TLR4、CD14和CR3等受體分子可以介導殼寡糖與巨噬細胞的結合［10，12，13］。但是有關哪個受體在介導殼寡糖的內吞中發(fā)揮關鍵受體的作用，目前還沒有明確的觀點。近年來，有很多研究發(fā)現(xiàn)多糖的免疫調節(jié)作用與Toll樣受體有關。如:桔梗根多糖通過Toll樣受體4(TLR4)激活巨噬細胞［15］;刺五加多糖通過TLR4激活B細胞和巨噬細胞［16］;紅花多糖通過TLR4激活轉錄因子NF-кB誘導巨噬細胞合成細胞因子［17］。脂多糖(LPS)可以與巨噬細胞表面TLR4受體相互作用，誘導細胞內 MAPK-NF-кB 信號轉導通路［18］。Wu［13］也曾報道過殼寡糖對巨噬細胞的激活作用與TLR4受體有關。本研究將殼寡糖用FITC進行熒光標記，在熒光顯微鏡下觀察到腹腔巨噬細胞能夠吞噬FITCCOS，但是細胞經TLR4單克隆抗體預處理后，細胞對殼寡糖的吞噬被完全抑制。結果表明TLR4在介導巨噬細胞吞噬殼寡糖進而被激活的過程中發(fā)揮關鍵受體的功能。

在上述研究的基礎上，本文進一步研究了酶解制備的殼寡糖的體外、體內的免疫調節(jié)功能。結果顯示:殼寡糖不能促進小鼠PMφ的體外增殖，但是COS能夠顯著提高小鼠PMφ吞噬中性紅能力和分泌TNF-α 因子的能力，20 μg/ml為 COS刺激小鼠PMφ的最佳濃度。體內研究結果表明小鼠灌胃COS，能顯著提高小鼠血清中IgG的含量和小鼠的脾臟指數(shù)，但是對血清IgM的含量和胸腺指數(shù)沒有顯著影響，這可能是與殼寡糖能夠刺激小鼠的抗體生成能力有關。脾臟是機體體液免疫的主要器官，殼寡糖通過增強小鼠的脾臟指數(shù)，誘導體液免疫能力，而胸腺是機體細胞免疫的主要器官。殼寡糖對胸腺指數(shù)影響不顯著。

總之，本研究表明殼寡糖(3-7聚合度)能夠被巨噬細胞吞噬，進而激活巨噬細胞，具有較好的體外、體內免疫調節(jié)功能，殼寡糖對巨噬細胞的激活作用是通過細胞表面的TLR4受體介導的。本研究為進一步研究殼寡糖的生理學功能、作用機制和殼寡糖的開發(fā)應用奠定理論基礎。

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