熊茂來 (湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，恩施445000)

白血病是一種發(fā)生于造血組織的惡性疾病，其特點(diǎn)是某一類型白血病細(xì)胞在骨髓組織或其他造血組織中呈腫瘤性增生。白血病發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的第一位。在我國白血病的患者30%是兒童。急性髓系白血病 (Acute myeloid leukemia，AML)約占兒童急性白血病的20%，過去20年，5年生存率已上升至60%[1]。目前，化療是治療兒童白血病的主要方式，但復(fù)發(fā)、耐藥等問題還有待解決，如何從分子水平進(jìn)行靶向治療提高療效是近年來研究的熱點(diǎn)。

HOXA9(Homo sapiens homeobox A9)基因?qū)儆诟叨缺Ｊ赝春谢蚣易宓囊粏T，廣泛存在于果蠅、老鼠和人體內(nèi)，與胚胎體節(jié)發(fā)育和形態(tài)發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，HOXA9基因在80%AML患者中表達(dá)上調(diào)，是導(dǎo)致傳統(tǒng)治療失敗的獨(dú)立影響因素[2]。在白血病模型中，HOXA9基因的過表達(dá)，對(duì)抑制骨髓細(xì)胞的分化起了重要作用，使骨髓細(xì)胞停留在原始狀態(tài)[3]。因此，HOXA9基因有可能成為AML的分子治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過siRNA靶向沉默HOXA9基因表達(dá)，探討其對(duì)白血病K562細(xì)胞系的生物學(xué)影響，為進(jìn)一步研究其基因治療價(jià)值，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 K562細(xì)胞(購自中科院上海生化與細(xì)胞研究所);RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國HyClone公司;2×SYBER GREEN Mix購自TOYOBO公司;Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自碧云天;Lipofectamine 2000、TRIZOL購自 Invitrogen公司;Anti-HOXA9購自博士德公司;HOXA9-siRNA由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)分未處理組、siRNA陰性對(duì)照組、HOXA9-siRNA組。K562細(xì)胞采用 RPMI1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 設(shè)計(jì)合成HOXA9-siRNA 根據(jù)HOXA9在GeneBank中的序列，設(shè)計(jì)靶向HOXA9的siRNA序列5'-CCACGCACTGTGTTTCCTT-3'，陰性 siRNA 序列5'-GGACCTGTATGCGTACATT-3'，由上海吉瑪公司合成。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 參照Lipofectamine 2000說明書操作，12孔板中每孔K562細(xì)胞密度約為4×105個(gè)細(xì)胞，每孔轉(zhuǎn)2 μg質(zhì)粒。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄 收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)細(xì)胞，用 TRIZOL一步法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄參照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。

1.2.5 Real time PCR SYBER Green法檢測(cè)各組HOXA9 mRNA水平 以 GAPDH為內(nèi)參，以2-△△CT法分析各樣本CT值。HOXA9上游引物5'-GTCCCACGCTTGACACTC-3'，下游引物 5'-GTTGGCTGCTGGGTTATT-3';GAPDH上游引物5'-GGTATCGTGGAAGGACCATGAC-3'，下游引物 5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3';引物由上海生工合成。

1.2.6 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后72小時(shí)細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，于 12%SDS-PAGE電泳，按1∶1 000比例稀釋一抗，4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1小時(shí)，ECL法顯色。

1.2.7 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別收集轉(zhuǎn)染后24、48、72小時(shí)細(xì)胞，PBS沖洗兩次，每份樣本加 200 μl Annexin V-FITC 結(jié)合液、5 μl Annexin V、5 μl PI避光孵育15分鐘后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞HOXA9 mRNA水平的影響 Real time PCR法檢測(cè)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HOXA9基因mRNA水平改變，結(jié)果見圖1。

圖1 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞HOXA9 mRNA表達(dá)的影響Fig．1 Effect of HOXA9-siRNA on HOXA9 mRNA level in K562 cells

圖2 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞HOXA9蛋白表達(dá)的影響Fig．2 Effect of HOXA9-siRNA on HOXA9 protein level in K562 cells

2.2 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞HOXA9蛋白水平影響 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HOXA9蛋白水平變化，結(jié)果見圖2。

2.3 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞凋亡率的影響流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果見圖3、表1。

3 討論

圖3 HOXA9-siRNA對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響Fig．3 Effect of HOXA9-siRNA on K562 cells apoptosis

表1 各組凋亡率變化Tab．1 Apoptosis of three groups

越來越多的證據(jù)表明Hox基因家族在造血生長調(diào)控中起到重要作用[4]。在老鼠骨髓細(xì)胞中，HOXA9的過表達(dá)在3～8個(gè)月內(nèi)導(dǎo)致AML，表明其是先于AML發(fā)生，HOXA9的過表達(dá)成為與預(yù)后不良相關(guān)的獨(dú)立因素[2]。轉(zhuǎn)進(jìn)HOXA9的轉(zhuǎn)基因小鼠，與對(duì)照組相比，移植入的淋巴髓系細(xì)胞長期存活數(shù)量增加了15倍，表明HOXA9在促進(jìn)造血干細(xì)胞生長中的作用[5]。HOXA9在混合系白血病中表達(dá)胞、γδT淋巴細(xì)胞等，因此推斷干酪乳桿菌EPS可能具有調(diào)控IL-17主要分泌細(xì)胞的能力。

研究結(jié)果初步表明，干酪乳桿菌EPS可體外促進(jìn)腸相關(guān)組織中淋巴細(xì)胞增殖和調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-17的分泌，初步推斷干酪乳桿菌EPS具有調(diào)節(jié)腸相關(guān)淋巴組織淋巴細(xì)胞免疫活性的能力，能夠改善腸黏膜免疫系統(tǒng)。但EPS通過口服途徑到達(dá)腸道，以大分子形式接觸腸相關(guān)淋巴細(xì)胞后，是否仍具有與體外實(shí)驗(yàn)相符的功能仍需進(jìn)一步證實(shí)。

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