張繼成 呂文利 (武警湖北總隊醫(yī)院檢驗科，武漢 430061)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒童常見的慢性呼吸道過敏性疾病，以肺部可逆性阻塞、氣道黏膜炎癥和氣道高反應性為特征。哮喘發(fā)病機制非常復雜，目前認為Th1/Th2反應失衡導致Th2細胞過度激活是其重要的免疫學機制之一［1］。白細胞介素13(IL-13)是一種由Th2型細胞分泌的多效性細胞因子，介導變態(tài)反應的發(fā)生，與哮喘的發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)。

銀杏葉是治療哮喘的傳統(tǒng)中藥，銀杏葉提取物(EGB)是銀杏葉經(jīng)過多步驟分離提取后得到的天然活性物質(zhì)。研究證實，EGB具有廣泛的藥理作用，如拮抗血小板活化因子、清除自由基、抗炎及抗過敏等［2］。臨床研究發(fā)現(xiàn)EGB可以緩解哮喘發(fā)作，但具體機制尚不清楚。

BPA是生產(chǎn)防碎塑料的原料，廣泛應用于從礦泉水瓶、醫(yī)療器械到食品包裝的生產(chǎn)。環(huán)境中的BPA可通過消化道、呼吸道和皮膚接觸而吸收入體內(nèi)。動物試驗發(fā)現(xiàn)，BPA與小白鼠患哮喘相關(guān)聯(lián)，初步人體實驗顯示孕婦在妊娠早期受BPA影響可能會導致嬰兒患哮喘［3，4］。肥大細胞在哮喘發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，本研究以RBL(大鼠嗜堿性白血病細胞)作為肥大細胞的體外研究模型［5］，通過BPA刺激活化RBL，觀察EGB對活化RBL分泌IL-13和PKC活化的影響，探討其治療哮喘的可能機制。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 細胞株 RBL由仲人前教授(上海長征醫(yī)院)惠贈，使用DMEM(含10%新生小牛血清)培養(yǎng)基，在37℃、含5%CO2、飽和濕度的通用條件下培養(yǎng)。

1．1．2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基為GIBCOBRL產(chǎn)品;p-硝基苯基-N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷、BPA均購自Sigma;EGB為浙江康恩貝制藥股份有限公司產(chǎn)品;大鼠IL-13 ELISA試劑盒為上海森雄生物工程有限公司分裝; Western blot試劑購自北京中杉公司;蛋白酶抑制劑cocktail購自上海麥約爾生物技術(shù)公司;山羊抗大鼠PKC多克隆抗體購自Santa Cruz公司。

1．2 方法

1．2．1 噻唑藍(MTT)檢測 將 RBL細胞種入96孔板，每孔2×105細胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天用無血清DMEM洗兩遍，分別加入終濃度為40、80、160μg/ml的EGB，培養(yǎng)30分鐘，再加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng) 30分鐘。洗兩遍，加入MTT，培養(yǎng)4小時。吸棄上清液，加入 DMSO，混勻30分鐘后在酶標儀上測A570nm值。

1．2．2 空白組 將 RBL細胞種入12孔板，每孔6×105細胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天用無血清DMEM洗兩遍，加入培養(yǎng)基，培養(yǎng)30分鐘，取20μl上清測定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時。

1．2．3 BPA活化RBL組(BPA組) 將RBL細胞種入12孔板，每孔6×105細胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天用無血清DMEM洗兩遍，加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng)30分鐘，取上清測定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時。

1．2．4 EGB實驗組 將RBL細胞種入12孔板，每孔6×105細胞，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，第2天用無血清DMEM洗兩遍，分別加入終濃度為 40、80、160 μg/ml的EGB，培養(yǎng)30分鐘后，加入BPA(終濃度50μmol/L)，培養(yǎng)30分鐘，取上清測定β-氨基己糖苷酶，再繼續(xù)培養(yǎng)6小時。

1．2．5 β-氨基己糖苷酶分泌測定 加20μl待測上清和20μl 5 mmol/L p-硝基苯基-N-乙酰-β-D 氨基葡萄糖苷(溶于0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH4．5)于96孔板，每樣品做三個復孔，37℃孵育2小時，加入 200μl 0．1 mol/L碳酸鈉鹽緩沖液(pH11)終止反應，在酶標儀上讀取405 nm的OD值。用未刺激的RBL加0．1%Triton X-100溶解細胞后，取上清測定β-氨基己糖苷酶總活性。按下面公式計算樣品的β-氨基己糖苷酶釋放(%)，實驗樣品所測OD值/β-氨基己糖苷酶總活性所測OD值×100%。

1．2．6 IL-13的檢測 IL-13測定采用雙抗體夾心ELISA法，按試劑盒說明書進行。

1．2．7 細胞漿和細胞膜蛋白提取液的制備 收獲RBL細胞，用冷PBS洗滌2次，加入300μl緩沖液A(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，0．25 mmol/L 蔗糖，2 mmol/L EDTA，2 mmol/L EGTA)，同時加入蛋白酶抑制劑cocktail，用超聲細胞粉碎儀粉碎細胞，每次持續(xù)30秒，間隔3秒，共處理4次。將超聲粉碎后的細胞勻漿液經(jīng)超速離心機(美國Beckman)超速離心(35 000 r/min 4℃，60分鐘)，取上清液即為胞漿蛋白提取液，在沉淀部分中加入300μl含有蛋白酶抑制劑cocktail的緩沖液B(20 mmol/L Tris-HCl pH7.5，1% Nonidet P-40，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA)，冰浴30分鐘，超速離心(35 000 r/min 4℃，15分鐘)，上清液即為胞膜蛋白提取液。用BSA法對細胞漿和細胞膜蛋白提取液進行蛋白定量。

1．2．8 Western blot檢測 PKC 取30μg蛋白上SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉后，加一抗(羊抗大鼠PKC)孵育，洗滌后加二抗(堿性磷酸酶標記的兔抗山羊IgG)孵育，洗滌后用NBT/BCIP試劑盒顯色。掃描膜，計算機軟件處理，進行密度分析，計算每組樣本細胞膜與細胞漿的灰度比值，以此代表各組細胞PKC的轉(zhuǎn)位(即PKC活化)情況。

2 結(jié)果

2．1 MTT結(jié)果 各組所測的A570nm吸光度值無明顯差異，說明實驗所用各濃度EGB對RBL細胞增殖無明顯影響(表1)。

2．2 EGB對于BPA活化RBL脫顆粒的影響 未加BPA活化的RBL(空白組)，其自發(fā)的β-氨基己糖苷酶釋放僅為3．8%，加50μmol/L濃度 BPA(BPA組)活化后的RBL，其β-氨基己糖苷酶釋放達41．6%，與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。加 EGB后，對BPA活化 RBL釋放 β-氨基己糖苷酶產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB使用濃度增加而加大，當 EGB濃度為160 μg/ml時，其 β-氨基己糖苷酶釋放降低到18．7%(表2)，與BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。

2．3 EGB對于BPA活化RBL分泌IL-13的影響RBL活化前，IL-13 分泌量為 33．6 pg/ml，加 50 μmol/L濃度BPA活化后，RBL分泌IL-13明顯增加，達95.4 pg/ml，與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。加EGB后，對活化RBL分泌IL-13產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB濃度增加而加大，當EGB濃度為160μg/ml時，其IL-13分泌量下降至45．3 pg/ml(表3)，與 BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 EGB對RBL細胞活性的影響 ±s，n=3)Tab．1 Effects of EGB on the RBL cells viability ±s，n=3)

表1 EGB對RBL細胞活性的影響 ±s，n=3)Tab．1 Effects of EGB on the RBL cells viability ±s，n=3)

_Groups A570nm Blank group 0．96 ±0．21 BPA(50 μmol/L)group 0．98 ± 0．24 BPA+EGB(40 μg/ml)group 0．97 ±0．17 BPA+EGB(80 μg/ml)group 0．95 ±0．18_BPA+EGB(160μg/ml)group 0．95 ±0．20_____

表2 EGB對于BPA活化RBL脫顆粒的影響 ± s，n=3)Tab．2 Effects of EGB on the release of β-hexosam inidase from RBL treated with BPA± s，n=3)

表2 EGB對于BPA活化RBL脫顆粒的影響 ± s，n=3)Tab．2 Effects of EGB on the release of β-hexosam inidase from RBL treated with BPA± s，n=3)

Groups Release of______________________________________β-hexosaminidase(%)Blank group 3．8 ±0．5 BPA(50 μmol/L)group 41．6 ±7．9 BPA+EGB(40 μg/ml)group 33．1 ±6．2 BPA+EGB(80 μg/ml)group 24．3 ±5．1_BPA+EGB(160μg/ml)group 18．7 ±2．9_____

表3 EGB對于BPA活化RBL分泌IL-13的影響(x ±s，n=3)Tab．3 Effects of EGB on the secretion of IL-13 from RBL treated with BPA(x ± s，n=3)

2．4 EGB對于活化RBL細胞PKC轉(zhuǎn)位的影響未加BPA活化時，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值為0．11，加50μmol/L濃度 BPA活化后，RBL細胞中PKC活化，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，胞膜與胞漿PKC的灰度比值上升為1．04，與空白組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)。加入EGB后，對于活化RBL細胞的PKC轉(zhuǎn)位產(chǎn)生了明顯的抑制作用，當EGB濃度為160μg/ml時，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值下降為0.25(表4，圖1、2)，與BPA組相比，三種劑量的EGB組差異明顯，均有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。

表4 EGB對于活化RBL細胞PKC轉(zhuǎn)位的影響 ±s，n=3)Tab．4 Effects of EGB on the translocation of PKC in RBL treated with BPA± s，n=3)

表4 EGB對于活化RBL細胞PKC轉(zhuǎn)位的影響 ±s，n=3)Tab．4 Effects of EGB on the translocation of PKC in RBL treated with BPA± s，n=3)

Groups Ratio ofmembrane PKC________________________________________________________tocytosolic_PKC Blank group 0．11 ± 0．03 BPA(50 μmol/L)group 1．02 ± 0．26 BPA+EGB(40 μg/ml)group 0．71 ± 0．22 BPA+EGB(80 μg/ml)group 0．37 ± 0．08 BPA+EGB(160μg/ml)group 0．25 ± 0．06

圖1 PKC在RBL胞膜中的表達Fig．1 Expression of PKC in themembrane of RBL

圖2 PKC在RBL胞漿中的表達Fig．2 Expression of PKC in the cytoplasm of RBL

3 討論

哮喘是以肥大細胞、嗜酸性粒細胞浸潤為主，多種細胞參與的變態(tài)反應性慢性炎癥性疾病，其中肥大細胞是哮喘發(fā)生的主要效應細胞。肥大細胞表面表達高親和力IgE受體［6，7］，當特異性抗原與肥大細胞表面兩個以上的IgE分子結(jié)合，發(fā)生橋聯(lián)反應，激活肥大細胞，活化信號通過傳導，激活蛋白激酶C(Protein kinase，PKC)和下游分子，使肥大細胞脫顆粒，釋放許多細胞因子和其它生物活性介質(zhì)，導致平滑肌收縮和微血管通透性升高，并募集炎癥細胞，引起組織損傷和變態(tài)反應。

銀杏葉提取物具有平喘止咳的功效［8］，其有效藥用成分主要包括銀杏黃酮和銀杏萜類內(nèi)酯，因此人們認為，其療效與銀杏內(nèi)酯對血小板激活因子(PAF)的拮抗作用有關(guān)。但是隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多比銀杏內(nèi)酯作用更強的PAF受體拮抗劑對哮喘無效，而銀杏葉提取物治療哮喘卻取得明顯效果，提示銀杏葉提取物對哮喘的作用不只是拮抗PAF受體，還存在其它作用機制，有待進一步研究闡明。

本實驗首先研究了EGB對BPA刺激活化RBL脫顆粒的影響。RBL活化后，通過脫顆粒釋放包括β-氨基己糖苷酶在內(nèi)的許多生物活性介質(zhì)，實驗中常常通過檢測β-氨基己糖苷酶作為監(jiān)測活化RBL脫顆粒情況的一個可靠指標。我們的實驗結(jié)果顯示，經(jīng)BPA刺激后，RBL活化并脫顆粒，而加入EGB后，活化RBL細胞脫顆粒受到了極大地抑制，說明EGB具有抗過敏反應的作用。

BPA具有免疫調(diào)節(jié)作用，它能刺激免疫細胞分泌Th2類細胞因子，促進過敏性炎癥反應發(fā)生［9］。大量的實驗研究證實IL-13在哮喘發(fā)病機制中起中軸作用［10，11］。IL-13可以誘導 B細胞合成 IgE而引發(fā)哮喘，此外，IL-13還專門表達于支氣管上皮細胞，通過非淋巴細胞依賴途徑誘導哮喘。IL-13在肺中誘導TGF-β產(chǎn)生，促進哮喘患者的肺纖維化。嗜酸性粒細胞(EOS)是哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵效應細胞，IL-13誘導eotaxin-1、eotaxin-2和eotaxin-3等細胞因子表達于上皮細胞和平滑肌細胞上，可促進肺部大量EOS浸潤。因此，我們通過ELISA檢測了各組RBL細胞分泌的IL-13。研究結(jié)果顯示，未經(jīng)BPA刺激的RBL，其 IL-13分泌量很低，僅33．6 pg/m l;加50μmol/L濃度BPA刺激活化后，RBL分泌IL-13明顯增加，達95．4 pg/m l，說明BPA能活化RBL，使之IL-13分泌增加。加EGB后，對活化RBL分泌IL-13產(chǎn)生了極大地抑制作用，且抑制作用隨EGB濃度增加而加大，當EGB濃度為160μg/ml時，其IL-13分泌量下降至45．3 pg/m l，說明EGB能抑制BPA對RBL的活化，減少IL-13的分泌。

PKC是肥大細胞活化信號轉(zhuǎn)導中的一個關(guān)鍵酶［12，13］。肥大細胞受刺激活化后，胞漿 Ca2+濃度升高，二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解產(chǎn)生第二信使二?；视?DAG)，DAG能與胞漿內(nèi)非活化型PKC結(jié)合，并在膜磷脂和鈣協(xié)同作用下使之活化，使其從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，這種轉(zhuǎn)位是PKC活化的標志。活化的PKC能磷酸化細胞膜蛋白(包括離子通道或受體等)和細胞骨架蛋白(微管蛋白、微絲蛋白以及肌球蛋白輕鏈)，從而觸發(fā)肥大細胞脫顆粒。PKC活化后，還可通過MAPK途徑，使NF-κB活化，分泌細胞因子和生物活性介質(zhì)。因此，本實驗進一步研究了EGB對PKC活化的影響。實驗結(jié)果顯示，在活化前，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值為0．11，經(jīng)BPA刺激活化后，RBL細胞中的PKC活化，從胞漿轉(zhuǎn)位至胞膜，胞膜與胞漿PKC的灰度比值為上升為1．02;但是，在加入EGB后，對于活化RBL細胞的PKC轉(zhuǎn)位產(chǎn)生了明顯的抑制作用，當EGB濃度為160μg/ml時，RBL胞膜與胞漿PKC的灰度比值下降為0．25。結(jié)果說明，EGB通過抑制PKC活化，進而對RBL活化脫顆粒以及分泌IL-13產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果提示，銀杏葉制劑對哮喘的治療作用部分可能與其抑制PKC的活化，進而抑制肥大細胞脫顆粒和分泌IL-13有關(guān)。

1 Hams E，F(xiàn)allon PG．Innate type 2 cells and asthma［J］．Curr Opin Pharmacol，2012;12(4):503-509．

2 姜秀娥．銀杏葉提取物的藥理作用及其臨床應用［J］．內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010;29(14):108-109．

3 Midoro-Horiuti T，Tiwari R，Watson C S et al．Maternal bisphenol a exposure promotes the development of experimental asthma in mouse pups［J］．Environ Health Perspect，2010;118(2):273-277．

4 Spanier A J，Kahn R S，Kunselman A R．Prenatal exposure to bisphenol A and child wheeze from birth to 3 years of age［J］．Environ Health Perspect，2012;120(6):916-920．

5 Passante E，Ehrhardt C，Sheridan H etal．RBL-2H3 cells are an imprecisemodel formast cellmediator release［J］．Inflamm Res，2009;58:611-618．

6 Bax H J，Keeble A H，Gould H J．Cytokinergic IgE action in mast cell activation［J］．Front Immunol，2012;3:229-229．

7 Iyer A S，Morales JL，HuangW etal．Absence of Tec family kinases interleukin-2 inducible T cell kinase(Itk)and Bruton's tyrosine kinase(Btk)severely impairs Fc cepsilonRI-dependent mast cell responses［J］．JBiol Chem，2011;286(11):9503-9513．

8 姚一鳴，姚錦輝．舒血寧注射液對支氣管哮喘患者肺功能的影響［J］．河北醫(yī)學，2009;15(2):138-141．

9 Lee J，Lim K T．Plant-originated glycoprotein(36 kDa)suppresses interleukin-4 and-10 in bisphenol A-stimulated primary cultured mouse lymphocytes［J］．Drug Chem Toxicol，2010;33(4):421-429．

10 Townley R G，Sapkota M，Sapkota K．IL-13 and its genetic variants:effecton current asthma treatments［J］．Discov Med，2011;12(67):513-523．

11 Mitchell J，Dimov V，Townley RG．IL-13 and the IL-13 receptor as therapeutic targets for asthma and allergic disease［J］．Curr Opin Investig Drugs，2010;11(5):527-534．

12 Lessmann E，Leitges M，Huber M．A redundant role for PKC-epsilon in mast cell signaling and effector function［J］．Int Immunol，2006;18(5):767-773．

13 Kato N，Motohashi S，Okada T et al．PICOT，protein kinase C theta-interacting protein，is a novel regulator of FcepsilonRI-mediated mast cell activation［J］．Cell Immunol，2008;251(1):62-67．