李 彤，張 娟，張桂珍，徐江濤，張 萍，蔣 俊，孫秀華，杜珍武

（1.遼寧省沈陽市胸科醫(yī)院急癥科，遼寧沈陽 110044；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，吉林 長春 130033）

TLR8基因多態(tài)性與中國東北地區(qū)漢族肺結(jié)核病的關(guān)聯(lián)性分析

李 彤1，張 娟1，張桂珍2，徐江濤1，張 萍1，蔣 俊1，孫秀華1，杜珍武2

（1.遼寧省沈陽市胸科醫(yī)院急癥科，遼寧沈陽 110044；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院中心研究室，吉林 長春 130033）

目的：探討Toll樣受體8（TLR8）基因的4個位點單核苷酸多態(tài)性（SNP）與我國東北地區(qū)漢族人群結(jié)核病的關(guān)聯(lián)性，分析其基因型頻數(shù)分布在肺結(jié)核病與其他肺病間的差異。方法：采用病例－對照的研究方法。選擇中國東北地區(qū)368例漢族肺結(jié)核病患者 （病例組）和355例漢族其他肺病患者 （對照組）為研究對象。應用連接酶特異檢測技術(shù)檢測2組患者TLR8基因4個位點rs3764880、rs3761624、rs3788935和rs3764879的基因型，比較2組患者等位基因頻數(shù)分布差異，計算其危險系數(shù)（OR），并比較不同性別患者組間基因型頻數(shù)分布的差異。結(jié)果 ：TLR8基因rs3764880、rs3761624、rs3788935和rs3764879位點等位基因型頻數(shù)在2組間分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同性別的2組患者TLR8基因4個位點等位基因頻數(shù)分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：TLR8基因位點rs3764880、rs3761624、rs3788935和rs3764879的SNP在我國東北地區(qū)漢族肺結(jié)核患者與其他肺病患者中的分布相同，提示上述TLR8基因4個位點的SNP與結(jié)核病的發(fā)生無關(guān)聯(lián)性。

TLR8基因；單核苷酸多態(tài)性；肺結(jié)核

結(jié)核病依舊是目前全球性重大的公共衛(wèi)生和社會問題。經(jīng)大范圍流行病學調(diào)查與長期追蹤觀察發(fā)現(xiàn)：結(jié)核病患者占全球結(jié)核桿菌感染人數(shù)的1／3，但發(fā)病患者人群不到10%［1］。隨著結(jié)核病發(fā)病機理研究的不斷深入，遺傳因素在決定宿主個體對結(jié)核分枝桿菌的易感性上的重要作用逐漸得到重視。一些與結(jié)核病發(fā)病易感性相關(guān)基因以及相應的位點逐 漸 被 發(fā) 現(xiàn)［2－6］。Toll樣 受 體 （Toll－like－recptor，TLR）是人們在研究果蠅胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的dToll基因所編碼的一種跨膜受體蛋白，在啟動和調(diào)節(jié)天然免疫、誘導獲得性免疫中起到重要作用，另外在腫瘤、心血管疾病和自身免疫的發(fā)生發(fā)展中亦扮演了重要角色［7］。一些研究［8－10］表明：TLR8基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）與肺部疾病包括肺結(jié)核易感性有關(guān)聯(lián)。2008年新加坡基因研究所的科學家發(fā)現(xiàn)：Toll樣受體8（Toll－like receptor 8，TLR8）基因的4個SNP位點rs3764880、rs3761624、rs3788935和rs3764879的多態(tài)性與印尼人和俄國人的結(jié)核病易感性密切相關(guān)［11］。由于TLR8基因位于X染色體上，而男性只有一條X染色體，因此男性攜帶致病位點從而感染結(jié)核病的概率更大［11］。印尼人與中國人的基因變異相似，但該結(jié)果是否也同樣適用于我國尚未見報道。本研究初步探討TRL8基因上述4個SNP位點在結(jié)核病患者和其他肺部疾病患者的分布，并分析該基因4個SNP位點在二者之間分布差異，從而為進一步研究上述4個位點是否能作為我國肺結(jié)核發(fā)病的易感基因位點奠定實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 研究對象 368例漢族肺結(jié)核患者均為2009年5月—2011年10月沈陽市胸科醫(yī)院結(jié)核病房收治的患者。結(jié)核病診斷依據(jù)2008年WHO制定的結(jié)核病診斷標準，同時符合結(jié)核菌素試驗≥5mm，排除肺結(jié)核病并發(fā)活動性肺外結(jié)核病者和非結(jié)核分枝桿菌肺病患者。355例對照組研究對象為2009年7月—2011年7月沈陽市胸科醫(yī)院收治的漢族非結(jié)核病患者，符合無結(jié)核病既往史和結(jié)核病家族史、有卡介苗接種史、PPD（－）、TB－AB（－）、肺部CT影像除外肺內(nèi)活動性結(jié)核病變，痰涂片和培養(yǎng)查結(jié)核菌均呈陰性（－）。病例組和對照組研究對象均無輸血史、無器官移植史、無吸毒史。本研究取得了沈陽市胸科醫(yī)院倫理委員會的批準，并征得患者本人同意。TLR8基因4個位點的基因型頻數(shù)分布在病例組和對照組均符合Hardy Weinberg平衡（P＞0.05）。病例組患者年齡為（54±16）歲，對照組患者年齡為（52±18）歲，2組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；病例組男性260例（70.7%），女性108例（29.3%）；對照組男性226例（63.6%），女性129例（36.4%），病例組與對照組之間的性別構(gòu)成比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 標本采集及外周血白細胞DNA的提取 所有研究對象均采集靜脈血5mL，經(jīng)EDTA抗凝，4℃冰箱保存。采用TIANGEN公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進行基因組DNA提取，溶于Tris－EDTA溶液，于－20℃凍存。

1.3 TLR8基因多態(tài)性分析 根據(jù)參考文獻［11］，針對 TLR8 基因的 4 個 SNP 位點rs3764880、rs3761624、rs3788935和rs3764879采用連接酶檢測反應（LDR）分型方法［12］檢測基因型，委托上海捷瑞生物技術(shù)公司完成。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計學分析。病例組和對照組等位基因頻數(shù)組間比較采用χ2檢驗，計算OR值以及其95%可信區(qū)間。

2 結(jié) 果

2.1 TLR8基因4個SNP位點多態(tài)性檢測結(jié)果采用連接酶特異檢測技術(shù)檢測TLR8基因4個SNP位點的峰圖，其中S3：rs3788935測得基因型為AA、GG和GA；S1：rs3764880測得基因型為AA、GG和GA；S2：rs3761624測得基因型為AA、GG和GA；S4：rs3764879測得基因型為CC、GG和GC。見圖1。

2.2 TLR8基因4個SNP位點多態(tài)性在2組患者中的分布 TLR8基因4個SNP位點的等位基因型頻數(shù)分布在病例組與對照組患者之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 不同性別患者TLR8基因4個SNP位點等位基因頻數(shù)分布 男性患者TLR8基因4個SNP位點的等位基因頻數(shù)分布見表2。女性患者TLR8基因4個SNP位點的等位基因頻數(shù)分布見表3。病例組與對照組不同性別患者之間TLR8基因4個SNP位點多態(tài)性的等位基因頻數(shù)分布比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 TLR8基因4個SNP位點的基因型Fig.1 Genotypes of four SNP sites on TLR8gene

表1 2組患者TLR8基因4個SNP位點基因型頻數(shù)的分布Tab.1 Distribution of genotypic frequencies of four SNP sites on TLR8gene of patients in two groups［n（η／%）］

表2 2組男性患者TLR8基因4個SNP位點等位基因頻數(shù)的分布Tab.2 Distribution of allelic frequencies of four SNP sites on TLR8gene of male patients in two groups ［n（η%）］

表3 2組女性患者TLR8基因4個SNP位點等位基因頻數(shù)的分布Tab.3 Distribution of allelic frequencies of four SNP sites on TLR8gene in female patients in two groups ［n（η／%）］

3 討 論

結(jié)核桿菌感染者發(fā)病因素復雜，以前的研究多集中于環(huán)境因素方面。研究［13－14］顯示：在我國影響結(jié)核發(fā)病的環(huán)境因素主要包括精神壓力、營養(yǎng)不良、并發(fā)其他感染（如HIV感染）和衰老等。隨著結(jié)核病發(fā)病機理研究的不斷深入和分子生物學技術(shù)的高速發(fā)展，遺傳因素在結(jié)核病發(fā)病中的作用越來越受到人們的重視。有充分的證據(jù)［15－16］顯示：遺傳因素在決定宿主個體對結(jié)核分枝桿菌的易感性上起著重要的作用。

TRL8基因是結(jié)核桿菌感染肺部組織過程中的關(guān)鍵基因，研究［11］發(fā)現(xiàn)：該基因的某些位點變異在印尼人和俄國人與結(jié)核病的易感性有密切關(guān)系。本研究探討該基因的4個SNP位點多態(tài)性在結(jié)核病患者人群中和其他肺病患者中分布的差異性。對我國東北地區(qū)700余名肺部疾病患者的TRL8基因4個位點基因型的分析研究顯示：該基因致病基因型（rs 3764879：C；rs3788935：A；rs3761624：A；rs3764880：A）在我國北方漢族人群肺結(jié)核病患者的分布為12%～16%，而在印尼人結(jié)核患者中為30%以上，在俄國人結(jié)核患者約為80%［11］。因此我國東北漢族人TRL8基因4個SNP位點的致病基因型的分布頻數(shù)遠低于上述國家，說明不同種族之間存在TRL8基因多態(tài)性分布差異。

本研究結(jié)果顯示：TLR8基因4個SNP位點等位基因頻數(shù)分布在結(jié)核患者與其他肺病患者之間差異無統(tǒng)計學意義，在不同性別患者中等位基因分布在二類患者之間差異也無統(tǒng)計學意義。TLR8基因作為與肺部疾患有密切關(guān)聯(lián)的基因［17－20］，其4個SNP位點可能為所有肺病包括肺結(jié)核病的易感基因，即具有相同TLR8基因多態(tài)性遺傳背景的患者，在不同環(huán)境因素的影響下可發(fā)生不同的肺部疾患。但上述的推測還需進一步的實驗研究證明。

［1］World Health Organization. Global luberculosis control：surveillance，planning financing［C］.Geneva，Switzerland：World Health Organization，2007.

［2］Liu W，Cao WC，Zhang CY，et al.VDR and NRAMP1gene polymorphisms in susceptibility to pulmonary tuberculosis among the Chinese Han population：a case－control study［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2004，8（4）：428－434.

［3］陳雪融，馮玉麟，唐曉燕，等.維生素D受體基因多態(tài)性對中國藏族肺結(jié)核病人排菌情況的影響［J］.中國呼吸與危重監(jiān)護雜志，2006，5（11）：42－45.

［4］Liu W，Zhang F，Xin ZT，et al.Sequence variations in the MBL gene and their relationship to pulmonary tuberculosis in the Chinese Han population ［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2006，10（10）：1098－1103.

［5］Ates O，Musellim B，Ongen G，et al.Interleukin－10and tumor necrosis factor－alpha gene polymorphisms in tuberculosis［J］.J Clin Immunol，2008，28（3）：232－236.

［6］Pacheco AG，Cardoso CC，Moraes MO.IFNG＋874T／A，IL10－1082G／A and TNF－308G／A polymorphisns in association with tuberculosis susceptibility a meta－analysis study［J］.Hum Genel，2008，123（5）：477－484.

［7］Li LY.The advance research of toll－like receptors［J］.Clin Med Engineering，2011，3（18）：467－469.

［8］Dalgic N，Tekin D，Kayaalti Z，et al.Relationship between toll－like receptor 8gene polymorphisms and pediatric pulmonary tuberculosis［J］.Dis Markers，2011，31（1）：33－38.

［9］Nilsson D，Andiappan AK， Halldén C，et al. Toll－like receptor gene polymorphisms are associated with allergic rhinitis：a case control study ［J］.BMC Med Genet，2012，2（13）：66.

［10］Oh DY，Taube S，Hamouda O，et al.A functional toll－like receptor 8variant is associated with HIV disease restriction［J］.J Infect Dis，2008，198（5）：701－709.

［11］Davila S，Hibberd ML， Hari Dass R，et al. Genetic association and expression studies indicate a role of toll－like receptor 8in pulmonary tuberculosis［J］.PLoS Genet，2008，4（10）：e1000218.

［12］Zhang Z，Li Y，Zhao Q，et al.First evidence of association between G72and bipolar disorder in the Chinese Han population［J］.Psychiatr Genet，2009，19（3）：151－153.

［13］李 斌，王兆芬，劉 壽，等.中國人群肺結(jié)核發(fā)病危險因素的 meta分析［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2009，28（5）：527－529.

［14］唐惠紅，何志青，龔 芳，等.青壯年肺結(jié)核發(fā)病影響因素的條件Logistic回歸分析［J］.實用預防醫(yī)學，2012，19（6）：830－833.

［15］Azad AK，Sadee W，Schlesinger LS.Innate immune gene polymorphisms in tuberculosis ［J］.Infect Immun，2012，80（10）：3343－3359.

［16］Qidwai T，Jamal F，Khan MY.DNA sequence variation and regulation of genes involved in pathogenesis of pulmonary tuberculosis［J］.Scand J Immunol，2012，75（6）：568－587.

［17］Hammerbeck DM， Burleson GR， Schuller CJ， et al.Administration of a dual toll－like receptor 7and toll－like receptor 8agonist protects against influenza in rats ［J］.Antiviral Res，2007，73（1）：1－11.

［18］M?ller－Larsen S， Nyegaard M， Haagerup A， et al.Association analysis identifies TLR7and TLR8as novel risk genes in asthma and related disorders ［J］.Thorax，2008，63（12）：1064－1069.

［19］Yanagisawa S，Koarai A，Sugiura H，et al.Oxidative stress augments toll－like receptor 8mediated neutrophilic responses in healthy subjects［J］.Respir Res，2009，10：50.

［20］Samara KD， Antoniou KM， Karagiannis K， et al.Expression profiles of Toll－like receptors in non－small cell lung cancer and idiopathic pulmonary fibrosis ［J］.Int J Oncol，2012，40（5）：1397－1404.

Association analysis between polymorphism of TLR8gene and tuberculosis in Han population from Northeast China

LI Tong1，ZHANG Juan1，ZHANG Gui－zhen2，XU Jiang－tao1，ZHANG Ping1，JIANG Jun1，SUN Xiu－h(huán)ua1，DU Zhen－wu2
（1.Department of Accident and Emergency，Shenyang Chest Hospital，Shengyang 110044，China；2.Central Research Laboratoty，China－Japan Union Hospital，Jilin University，Chuangchun 130033，China）

Objective To explore the correlation between single nucleotide polymorphism（SNP）of four sites on the Toll－like receptor 8 （TLR8）gene and tuberculosis in Han population from Northeast china，and to analyze the differences of genotypic frequency distribution between tuberculosis and other lung diseases patients.Methods A case－control study for 368cases of tuberculosis patients（case group）and 355other lung disease patients（control group）in Han population from Northeast China was established.The ligase specific detection technology was carried out to detect the genotypes of rs3764880，rs3761624，rs3788935，and rs3764879sites on TLR8gene in two groups.The distribution of allelic frequencies（GF）of the patients in two groups were compared and the odds ratio（OR）and the distribution of genotypic frequencies of the patients with different gender were analyzed.Results The allelic frequency distribution of rs3764880，rs3761624，rs3788935，and rs3764879sites on TLR8 gene between case group and control group was not statistically significant（P＞0.05）；the distribution of allelic frequency of four sites on TLR8gene of patients with different gender between case group and control group was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion The distributions of SNP at rs3764880，rs3761624，rs3788935，and rs3764879sites on TLR8gene are same between tuberculosis and other lung disease patients in Han population from Northeast China，which indicates that there is no association between SNP of four sites on TLR8gene and the occurrence of tuberculosis.

Toll－like receptor 8gene；single nudeotide polymorphism；tuberculosis

R563.9

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0584－04

10.7694／jldxyxb20130333

2012－10－19

遼寧省沈陽市科技局科技攻關(guān)項目資助課題 （F10－149－9－26）

李 彤 （1969－），女，遼寧省營口市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，主要從事肺結(jié)核病分子病理學研究。

杜珍武 （Tel：0431－84995423，E－mail：phdzhw＠yahoo.com.cn）