李桂珍，趙俊芳，陳雪雯，王 蓉，王玉亮

(1天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120;2天津市第一中心醫(yī)院)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是多種因素相互作用引起的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制復雜，與免疫調(diào)節(jié)異常有關(guān)［1］。OX40/OX40L是機體免疫應答過程中一對重要的協(xié)同刺激分子，參與了T細胞的活化、增殖、遷移以及生發(fā)中心的形成和樹突狀細胞的分化成熟，在機體的免疫應答和多種疾病中具有重要作用。Farres等［2］研究發(fā)現(xiàn)，OX40/OX40L與 SLE的發(fā)病密切相關(guān)。2012年6～11月，我們檢測了30例SLE患者及15例健康體檢者外周血 OX40、OX40L mRNA的表達，并對OX40/OX40L與SLE疾病活動程度的關(guān)系進行評估?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇天津市第一中心醫(yī)院收治的SLE患者30例(SLE組)，均為女性，年齡(36±7)歲，均符合1997年美國風濕病協(xié)會修訂的SLE分類標準。所有入選患者不伴有其他風濕性、代謝性和內(nèi)分泌疾病。根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評估疾病活動程度，SLEDAI≥10分為活動期，共15例，均為初診未治的初發(fā)活動期SLE患者或復發(fā)尚未再次治療的活動期SLE患者;SLEDAI＜10分為非活動期，共15例。同期選擇該院健康體檢女性15例作為對照組，年齡(33±7)歲。本研究經(jīng)過本院倫理委員會批準，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 異硫氰酸熒光素—小鼠抗人CD38單克隆抗體、藻紅蛋白—小鼠抗人CD3單克隆抗體(Biocytex公司，法國)，ABI 7300 PCR擴增儀(Applied Biosystems公司，美國)。FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2.2 外周血OX40、OX40L mRNA表達檢測 采用熒光定量RT-PCR法。所有研究對象于清晨空腹采集外周靜脈血，乙二胺四乙酸抗凝。應用TRIzol試劑(GIBCO-BRL公司，美國)提取外周血單個核細胞總 RNA，按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書操作合成 cDNA。OX40上游引物:5'-ACGACGTGGTCAGCTCCAA-3'，下游引物:5'-TCCGCTCACTCCCACTTCTG-3'，探針序列:5'-AAGCCCTGCACGTGGTGTAACC-3';OX40L上游引物:5'-CAGCCAGGCCAAGATTCG-3'，下游引物:5'-CAGCCCCAGTCCCTGAATT-3'，探針序列:5'-AGGAACAAGCTATTGCTGGTGGCCTCTG-3'。OX40、OX40L引物及探針序列為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。預實驗PCR擴增陽性產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下切下目的條帶。用回收試劑盒回收純化后，用OD260測定值和片段長度數(shù)據(jù)換算出濃度(拷貝/μL)，再做梯度稀釋，制備成定量PCR陽性定量標準品，熒光定量陰性物采用滅菌雙蒸水。PCR反應條件:50℃ 2 min，95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，兩組間比較采用獨立樣本資料t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗;OX40 mRNA表達水平與SLEDAI相關(guān)性分析采用Spearman檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組OX40、OX40L mRNA在外周血單個核細胞中的表達 SLE組外周血單個核細胞OX40 mRNA水平顯著高于對照組(P＜0.05)，活動期SLE患者外周血單個核細胞OX40 mRNA水平顯著高于非活動期患者和對照組(P＜0.05或＜0.01)?；顒悠赟LE患者組OX40L mRNA水平顯著高于非活動期患者和對照組(P ＜0.05或 ＜0.01)。見表1。

表1 各組OX40、OX40L mRNA在外周血單個核細胞中表達(拷貝/μL，ˉx ±s)

2.2 OX40、OX40L mRNA 表達水平與 SLEDAI的關(guān)系 Spearman相關(guān)分析顯示，OX40 mRNA表達水平與 SLEDAI呈正相關(guān)(r=0.35，P ＜0.05)，而 OX40L mRNA表達水平與SLEDAI無關(guān)(P＞0.05)。

3 討論

SLE是一種慢性自身免疫性疾病，屬于風濕性疾病中的彌漫性結(jié)締組織病。它可引起全身多個臟器受累，包括皮膚、關(guān)節(jié)、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)、血液、漿膜、呼吸和心臟等系統(tǒng)［3］。迄今為止，SLE仍無法根治。但是，隨著早期診斷手段的增多和治療水平的提高，SLE預后明顯改善，SLE的發(fā)病機理已經(jīng)逐漸被人們熟知。

研究顯示，免疫系統(tǒng)調(diào)控功能異常在SLE發(fā)病過程中具有重要作用，可造成SLE患者系統(tǒng)性病理損害，并引起一系列臨床癥狀。其中，共刺激分子異常表達在自身免疫性疾病的形成和發(fā)展中具有重要的促進作用，OX40、OX40L即是其中重要的共刺激分子。OX40屬于腫瘤壞死因子受體/神經(jīng)生長因子受體家族，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量約為50 kD。OX40是一個T細胞活化蛋白，只表達于活化的T細胞表面，且主要在細胞，部分細胞也表達。OX40L是OX40的配體，屬于腫瘤壞死因子(TNF)家族，是Ⅱ型跨膜蛋白，分子量約為34 kD，OX40L也只在活化的抗原提呈細胞上表達。OX40、OX40L在T細胞的活化、增殖、遷移以及生發(fā)中心的形成和DC的分化成熟過程中起重要作用［4］。Farres等［2］研究表明，SLE 患者 OX40+T 細胞百分數(shù)顯著高于健康體檢者，這種細胞在腎炎型SLE患者外周血中數(shù)量增加的更為顯著。盡管與健康體檢者相比，SLE患者外周血OX40+T細胞的絕對數(shù)相差無幾，但是SLE患者表達OX40 T細胞的百分率顯著高于健康體檢者，且與SLE的疾病活動程度密切相關(guān)。Manku等［5］證實了OX40在SLE患者的表達，且腎炎型SLE患者的T細胞上OX40的聚焦程度顯著高于非腎炎型SLE患者。Dolff等［6］研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者OX40表達水平高于健康體檢者，狼瘡腎炎患者OX40表達水平也高于健康體檢者，且腎活檢發(fā)現(xiàn)OX40+T細胞浸潤。近年研究還發(fā)現(xiàn)，OX40L能協(xié)同刺激T細胞的活化，促進B細胞產(chǎn)生高效價抗體，介導OX40+T細胞向炎癥部位浸潤［7］;同時OX40/OX40L在脂多糖等危險信號刺激下，與細胞質(zhì)內(nèi)信號傳導分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TRAF)-2、TRAF-3、TRAF-5 結(jié)合，上調(diào)核因子(NF)-κB的活性，使 Bcl-2、Bcl-xL等一系列抗凋亡分子高表達來抑制細胞凋亡，繼而維持CD+4T細胞的存活，促進CD+4T細胞穿過血管內(nèi)皮在炎癥位點募集［8］，從而打破自身耐受參與SLE的發(fā)病。這些研究結(jié)果均表明，OX40、OX40L與SLE的發(fā)病密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，活動期SLE患者外周血單個核細胞OX40、OX40L mRNA表達水平較非活動期SLE患者與健康體檢者明顯升高;OX40 mRNA表達水平與SLEDAI呈正相關(guān)。提示共刺激分子OX40變化與SLE疾病的活動性呈一定相關(guān)性，其可能在SLE的發(fā)病機制及病情進展中起作用。

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