林麗萍，張金添，朱婷婷，李繼香，林麗晶，方夢寒，林弘月，鄭劍聰

(莆田學院醫(yī)學院，福建 莆田 351100)

臨床中嚴重肝病患者，若出現上消化道大出血的并發(fā)癥，造成消化道內蛋白質的增多，可因細菌分解蛋白質產氨增多;高蛋白飲食，未經完全消化的蛋白成分在腸道潴留;肝硬變晚期合并腎功能障礙，通過腎臟排出的尿素減少，彌散入腸增加;以上因素均可使腸道的產氨量增加，誘發(fā)肝性腦病的發(fā)生［1］。因此，減少腸道氨的量及濃度可減少肝性腦病的發(fā)生發(fā)展［2］。本實驗通過化學毒物四氯化碳制作小鼠急性肝功能不全模型［3］，觀察造模期間小鼠的生理變化及病理檢查變化［4］，給予不同pH 值氨的溶液后肝性腦病臨床表現出現的快慢及嚴重程度，以及急性肝功能不全小鼠對不同pH值氨的耐受性［5］。

1 試劑與材料

1.1 試劑

四氯化碳(分析純 中國東陽化工廠)，植物油(市售花生油)，甲醛溶液(分析純 福建省三明市三圓化學試劑有限公司)

1.2 動物

SD 小鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，體重約15～25 g，購于福建疾病控制中心。標準飼料，飲水不限。適應喂養(yǎng)后開始實驗。

2 方 法

2.1 動物分組及處理

(1)隨機選取SD 小鼠50 只，隨機分為A、B、C、D、E 組，每組10 只，并標記如A1、A2…A10 等，A、B、C、D 組造模做實驗組，E 組正常喂食作為正常對照組，不做其他處理，直至取肝組織做病理;(2)將標記好的小鼠稱重并按10 mL/kg 的劑量給予實驗組小鼠0.4%四氯化碳花生油溶液，記錄注射時間并觀察注射后小鼠的一般狀態(tài);(3)距上次給藥后42 h 開始禁食6 h，再灌胃給予原劑量的0.4%四氯化碳花生油溶液; (4)24 h后，重復第(2)、(3)步;(5)并于6 h 后開始禁食6 h，再次稱量小鼠并記錄，再通過灌胃給予0.4%四氯化碳花生油溶液;(6)從末次給藥開始禁食不禁水16 h 后按0.5 mL/10g 分別腹腔注射給予A 組0.3 mol/L (pH =5)的氯化銨溶液、B 組pH=7 的氯化銨溶液、C 組pH =9 的氯化銨溶液、D 組pH=7 的生理鹽水溶液;(7)經第6 步后觀察肝性腦病表現，再將實驗組小鼠及對照組小鼠脊髓離斷處死，解剖取肝臟用10%甲醛溶液固定做病理切片檢查(HE 染色)。

2.2 檢測指標

觀察一般狀況: (1)造模期間小鼠的一般生理狀況及變化:包括毛色變化、飲食飲水狀況、排便排水、活動等; (2)實驗組與對照組的肝臟肉眼觀察及顯微病理變化;(3)給予不同pH 的氯化銨溶液后小鼠出現角膜消失、抽搐出現、樸翼樣震顫和角弓反張等臨床表現的嚴重程度及快慢［4］2849－2851。

2.3 統計方法

3 結 果

3.1 一般生長狀況

實驗組小鼠造模期間總共死亡3 只，進食減少，毛色黯淡，行動遲緩，尿黃，有的小鼠體重減輕，總的體重增幅明顯小于正常對照組，正常對照組小鼠無死亡，生長狀況良好，反應靈敏，毛色光滑，飲食飲水排便正常。

3.2 給予不同pH 值的氯化銨溶液后結果如下。

3.2.1 一般狀況

實驗組各組出現不同程度的興奮性先增高后降低如光聲刺激先增強后減弱，舔嘴、啄米樣動作、作嘔表現，行動遲緩且偶有跨閾步態(tài)，意識障礙，尿黃色乳糜狀，翻正反射消失，角膜反射消失，撲翼樣震顫，角弓反張，進而出現死亡或癥狀轉緩等變化。A、B、C 組結果見表1，D 組雖有肝功能不全的模型基礎，但給予生理鹽水后無明顯異常，死亡率為零。

3.2.2 組織病理學檢查

(1)大體改變(圖1):①實驗組:肝臟顏色變淺，質地較堅韌，表面凹凸不平有細小顆粒狀，無光澤，邊緣圓鈍，肝臟體積變小;②對照組:肝臟顏色鮮紅，肝緣銳利，肝實質柔軟，表面光滑細膩有光澤;(2)肝組織病理切片HE 染色光鏡下觀察:①實驗組:肝小葉結構紊亂，可見局部肝實質缺損，肝細胞壞死。肝細胞脂肪變性及水樣變性，匯管區(qū)及壞死區(qū)大量炎性細胞浸潤 (見圖2A、B);②對照組:肝小葉結構正常，肝細胞排列規(guī)整，無脂肪浸潤，無變性壞死，匯管區(qū)無炎性細胞浸潤(見圖2C、D)。

表1 急性肝功能不全小鼠肝性腦病臨床表現的出現時間(，n=10)

3.3 急性肝功能不全小鼠肝性腦病臨床表現出現時間的方差分析

4 討 論

化學毒物四氯化碳可特異性引起肝損害，將其溶于植物油，經灌胃及腹腔注射給藥制作急性肝功能不全模型［6］。四氯化碳造成肝細胞損傷的機制可能是自由基的形成及引發(fā)的鏈式過氧化反應，產生自由基－ CCl3，發(fā)生脂質過氧化，使內質網改變，溶酶體破裂和線粒體損傷及Ca2+通透變化，引起肝細胞急性損傷和破壞，再腹腔注射不同pH值的0.3 mol/L 的氯化銨溶液引起血氨急劇升高，在肝功能嚴重障礙的基礎上，一方面由于代謝障礙，ATP 不足以供給鳥氨酸循環(huán);另一方面，鳥氨酸循環(huán)的酶系統嚴重受損;以及鳥氨酸循環(huán)的各種底物缺失等均可使由氨合成尿素明顯減少，導致氨濃度增加［1］232－246。氨進入腦內與很多因素有關，氨屬于弱堿性，在血中主要以銨離子形式存在，正常情況下銨離子不易通過血腦屏障，當血漿pH 增高時NH3增多，可自由通過血腦屏障，進入腦內［7］。進入腦內的氨增多一方面使腦內的神經遞質平衡失調，興奮性遞質的量減少，而抑制性遞質的量增多;另一方面氨增多會干擾腦細胞的能量代謝，導致腦細胞完成各種功能所需的能量嚴重不足，還影響到鈉鉀泵的活性，影響膜電位、細胞的興奮及傳導等活動，所以pH 越高，氨通過血腦屏障越多，進而表現出肝性腦病的臨床表現越嚴重［8］。

如實驗結果所示，隨著A、B、C 組給予的氯化銨溶液pH 值的升高，各項癥狀出現的時間較早，且B、C 兩組的癥狀更為典型;C 組可能由于氨進入腦內的量更多，癥狀更嚴重，死亡率(70%)比A、B 兩組(分別為50%和60%)高，且可能由于病情比較嚴重，肝性腦病的癥狀并未全部表現出來便死亡。故提示血氨濃度越高，肝性腦病的程度將越重［9］。而D 組雖有肝功能衰竭的模型基礎，但給予生理鹽水后無明顯異常，死亡率為零，也提示血氨升高是誘導肝性腦病發(fā)生的重要因素。

由于小鼠的個體差異，所以給予不同pH 值的氯化銨后，有的小鼠在給藥后由于耐受性差，病情急劇發(fā)展較嚴重，未經歷相關病程直接死亡或缺失相關癥狀而死亡;有些小鼠耐受性較好，經歷相應病程出現相應癥狀后癥狀轉緩或死亡，故可能造成實驗結果未如預期理想。

綜上所述，四氯化碳可造成小鼠急性肝功能不全［10］，且急性肝功能不全小鼠對氨的耐受性隨著氯化銨溶液pH 值的升高而降低，肝功能不全癥狀表現的更嚴重。

圖1 對照組及實驗組肝臟病理大體觀

圖2 肝組織病理切片(HE 染色)

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