竇曉衛(wèi)，任春娥，柏宏偉，劉洪香，張安清

(濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042)

精子成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程，在睪丸內(nèi)生成的精子沒有良好的活動(dòng)能力。在從睪丸向附睪的輸送過程中逐漸完成形態(tài)和功能的轉(zhuǎn)變，因此附睪是促進(jìn)精子成熟、儲(chǔ)存的重要器官［1］。直鏈烷基苯磺酸鈉(linear alkylbenzene sulphonates，LAS)是合成洗滌劑的表面活性物質(zhì)，其對(duì)睪丸結(jié)構(gòu)和生殖能力的影響已有相關(guān)報(bào)道［2］，而亞慢性或慢性LAS染毒對(duì)哺乳動(dòng)物生殖能力的影響卻鮮有報(bào)道，尤其是對(duì)精子成熟過程及相關(guān)作用機(jī)制的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)采用昆明雄系小鼠作為動(dòng)物模型，觀察附睪頭和附睪尾精子的功能參數(shù)，結(jié)合與正常雌鼠交配后所生子代的情況，評(píng)價(jià)直鏈烷基苯磺酸鈉對(duì)小鼠精子成熟和生育能力的影響，為研究LAS 的生殖毒性機(jī)制提供相應(yīng)的參考資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 直鏈烷基苯磺酸鈉(LAS，C18，有效含量不低于95%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，伊紅染液、蘇木素染液、二甲苯、中性樹膠等，WLJY 精子分析系統(tǒng)，YD－AB 型生物組織攤烤片機(jī)，BX41TF 光學(xué)顯微鏡，H－7500透射電鏡等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及染毒模型的建立 健康雄性昆明小鼠60 只，鼠齡4 周，體重29～34 g，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組A (LAS 630 mg/kg)，實(shí)驗(yàn)組B (LAS 315 mg/kg)，對(duì)照組C (生理鹽水)，每組20 只。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)口攝入直鏈烷基苯磺酸鈉，每日1 次，連續(xù)染毒60 天，各組小鼠均常規(guī)飼養(yǎng)，光照10 h/d，自由飲食和飲水。雌鼠30 只，6～8 周齡，體重20～25 g，常規(guī)飼養(yǎng)1 周，用于與雄鼠的交配。

1.3 小鼠附睪精子參數(shù)的檢測(cè) 染毒60 天時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠，每組處死10 只，迅速解剖取附睪頭和附睪尾，分別置于1 mL 的生理鹽水中(37℃預(yù)熱)，孵育1 分鐘后，常規(guī)精液涂片，光學(xué)顯微鏡下至少觀察100 個(gè)精子，計(jì)數(shù)精子密度、活力及胞漿小滴率。應(yīng)用改良的巴氏染色法進(jìn)行精子形態(tài)學(xué)分析，計(jì)數(shù)精子畸形率，觀察精子畸形的種類。

1.4 小鼠附睪尾精子的透射電鏡觀察 常規(guī)方法制備小鼠附睪尾精子的透射電鏡切片［3］，觀察精子的超微結(jié)構(gòu)。

1.5 小鼠的生殖能力試驗(yàn) 經(jīng)各組中未處死的雄鼠(n=10)，分別與正常雌鼠交配，雌雄比例為1∶1，自合籠后起每日觀察雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓為懷孕的第1 天，計(jì)數(shù)孕鼠的比例，孕鼠常規(guī)飼養(yǎng)18 天后解剖，觀察胎鼠的情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所得結(jié)果采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間比較進(jìn)行單因素方差分析及q 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子各項(xiàng)功能參數(shù)的影響 對(duì)照組小鼠附睪尾精子多表現(xiàn)為快速向前運(yùn)動(dòng)，附睪頭精子運(yùn)動(dòng)相對(duì)微弱，多為原位擺動(dòng)或緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)。和對(duì)照組小鼠相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪頭和附睪尾精子密度、活力均顯著降低(P ＜0.001，P ＜0.05)，精子畸形率顯著升高(P ＜0.001)，且具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系(見表1－3)。對(duì)照組小鼠中附睪頭精子含胞漿小滴率為70.5%，附睪尾精子為29.9%;低劑量染毒組小鼠胞漿小滴率從附睪頭的72.7%降至附睪尾精子的41.6%，即有31.1%的胞漿小滴脫落;而精子胞漿小滴脫落的異常在高劑量染毒組小鼠中則變現(xiàn)的更為顯著，從附睪頭精子的79.8% 降到附睪尾精子的61.6%，即僅有18.2%的胞漿小滴脫落。見圖1。

表1 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子密度的影響(n=10，，×106/mL)

表2 LAS 對(duì)小鼠附睪頭和附睪尾精子活力的影響(n=10，，%)

表3 LAS 對(duì)小鼠畸形精子率的影響(n=10，，%)

2.2 LAS 對(duì)小鼠精子形態(tài)學(xué)的改變 光學(xué)顯微鏡下，對(duì)照組小鼠精子頭部呈鐮刀狀，尾部細(xì)長(zhǎng)，附睪頭精子和附睪尾精子最明顯的形態(tài)學(xué)差異在于胞漿小滴，附睪頭精子含胞漿小滴者多，且多位于尾部頸段，使精子尾部明顯彎曲。實(shí)驗(yàn)組小鼠附睪尾精子的胞漿小滴率明顯增加，且有多種頭部和尾部畸形，如雙頭、香蕉頭、斷尾等。透射電鏡下，對(duì)照組小鼠精子9 +2 結(jié)構(gòu)清晰，尾部線粒體排列緊密，大小形態(tài)一致。實(shí)驗(yàn)組小鼠精子的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為尾部線粒體排列疏松、腫脹、空泡形成等一系列凋亡前征象，并具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.3 LAS 對(duì)小鼠生育能力的影響 經(jīng)LAS 染毒后，低劑量組和高劑量組小鼠的生育能力均呈不同程度的下降，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，且呈現(xiàn)出效量效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組孕鼠腹中死胎+吸收胎鼠比例明顯高于對(duì)照組(P ＜0.05)。

表4 LAS 對(duì)小鼠生殖能力的影響

3 討 論

附睪作為雄性哺乳動(dòng)物的附屬性腺，是精子成熟、保護(hù)、運(yùn)輸、貯存的重要部位。附睪上皮細(xì)胞的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)等功能使精子發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能的改變，從而使精子獲得受精和運(yùn)動(dòng)能力［4］。本實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)LAS 染毒后的小鼠精子活力顯著降低，提示小鼠的附睪功能受到不同程度的損害，使小鼠精子的運(yùn)動(dòng)能力下降。

精子在附睪中的成熟要經(jīng)歷非常復(fù)雜的過程，其中最主要的變化時(shí)精子尾部的胞漿小滴和尾部的卷曲。正常情況下，伴隨著精子從附睪頭向附睪尾的移行過程中，胞漿小滴同時(shí)向尾部末端移動(dòng)，至精子成熟時(shí)，胞漿小滴隨之消失［5］。在附睪頭部，精子尾部呈卷曲狀，隨著精子的轉(zhuǎn)運(yùn)，尾部卷曲的精子數(shù)目逐漸下降，至附睪尾部時(shí)精子尾部變直。研究表明精子胞漿小滴貯留和附睪功能改變、生育力下降等有關(guān)［6］，主要原因是胞漿小滴貯留后改變了精子胞膜脂質(zhì)組成和代謝而使精子破裂增加［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明直鏈烷基苯磺酸鈉可以增加附睪尾部胞漿小滴的殘留率。另外，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠多見精子核空泡、頂體腫脹和線粒體排列紊亂等超微結(jié)構(gòu)的變化，說明精子在附睪階段發(fā)生了降解性改變，可見LAS 導(dǎo)致精子的附睪成熟降低。

哺乳動(dòng)物的生殖過程是從受精開始的，而受精能力的獲得是在附睪中完成的，本實(shí)驗(yàn)中觀察到二個(gè)染毒劑量組小鼠仍然保持生育能力，但較對(duì)照組顯著下降，同樣可作為附睪功能減退的證據(jù)。直鏈烷基苯磺酸鈉屬于低毒化學(xué)物質(zhì)，但其應(yīng)用廣泛并缺乏最低安全劑量標(biāo)準(zhǔn)［8］。近年來，LAS 的生殖毒性已引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注，研究表明LAS 可使生物體內(nèi)抗氧化酶活性降低，誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)過氧化作用，從而干擾細(xì)胞內(nèi)的各種代謝活動(dòng)，影響細(xì)胞的增值和分化［9］?，F(xiàn)今為止，在已婚夫婦當(dāng)中，大于15%的夫婦正受著不孕癥的困擾，其中大于50%是由于男性因素引起［10－11］，本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示LAS 的廣泛使用可能會(huì)造成潛在的生殖健康危害。包括LAS 等在內(nèi)的家用化學(xué)物品，在為人類帶來方便和潔凈的同時(shí)，造成了潛在的健康危害，構(gòu)成了社會(huì)衛(wèi)生和安全問題。因此，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)LAS 毒性作用機(jī)制的研究，為確定最低安全接觸量提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本實(shí)驗(yàn)以LAS 染毒小鼠作為研究模型，以附睪內(nèi)精子的各項(xiàng)功能指標(biāo)作為研究?jī)?nèi)容，可見LAS 影響了小鼠的附睪成熟過程，并為尋找LAS毒性作用的睪丸后靶點(diǎn)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。給予2 個(gè)不同劑量的LAS，高劑量組小鼠所受的影響最為顯著，此結(jié)果對(duì)男性生殖健康是有參考意義的。

圖2 正常精細(xì)形態(tài) HE×400

圖3 胞漿小滴陽性精子形態(tài) HE×400

圖4 正常精子尾部結(jié)構(gòu)(EM，×20000)，線粒體排列緊密，結(jié)構(gòu)清晰無空泡化現(xiàn)象

圖5 實(shí)驗(yàn)組小鼠精子結(jié)構(gòu)(EM，×20000)，胞漿內(nèi)大量空泡形成，精子9 +2 結(jié)構(gòu)不完整，線粒體數(shù)目減少，排列疏松

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