王浩，盛玉山，劉影，李艷芹

(1.遼寧醫(yī)學院藥學院;2.錦州市康寧醫(yī)院藥劑科;3.遼寧醫(yī)學院醫(yī)學實驗中心，遼寧 錦州 121000)

紫杉醇是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中分離得到的半合成單體抗癌活性成分，其作用于腫瘤細胞的微管蛋白而起作用，自1992 年被美國FDA 批準上市以來，已經(jīng)被用于乳腺癌，卵巢癌的一線治療藥物，其聯(lián)合用藥時對非小細胞肺癌等也有明顯療效，被認為是植物藥物發(fā)展史上的里程碑［1］。但是該藥毒副作用較強，除此之外，其不溶于水，現(xiàn)臨床應用的紫杉醇制劑是在臨床用藥前將其溶解于體積比為1∶1 的非離子型表面活性劑聚氧乙烯基蓖麻油(Cremphor EL)和乙醇混合溶液后，在靜注前再稀釋使用，但Cremphor EL 會將包裝袋材料中的小分子增塑劑等溶解到制劑中去，從而導致嚴重的過敏反應，再者，其在給藥時的稀釋操作會使制劑中析出結晶［2－3］。因而，減輕其毒副作用增加其治療指數(shù)，解決其水溶性，方便其臨床用藥的新制劑一直是研究的熱點［4］。

這其中，脂質體技術較多地被采用［5－7］，脂質體能夠在其膜相包載一些難溶性藥物，也能將水溶性藥物大量地包裹在內腔中，但是其在表面沒有經(jīng)過修飾時，靜脈注射后一般會被網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)(RES)識別，吞噬而轉運到肝脾等部位，在病灶部位的蓄積比例并不大。經(jīng)過聚乙二醇等修飾的脂質體的半衰期有所延長并通過滲透保留效應(EPR)而在病灶部位進行聚集而產(chǎn)生被動靶向作用，但其在反復注射后也會誘導網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)對其進行吞噬而導致半衰期逐漸變短，即加速的血液清除效應(ABC)在病灶部位的積蓄比例逐漸減少而失去靶向作用［8］。所以，脂質體給藥時若能在病變部位原位給藥的話可能是較理想的選擇，可將其進一步包裹在高分子中實現(xiàn)［9－12］。

原位給藥包括無載體的滯留針給藥和采用高分子為載體的植入給藥，體內植入的高分子材料首先要滿足兩個條件，機體相容性和生理/病理條件下的可降解和可清除性，脂肪族聚酯是現(xiàn)有的能滿足這兩個條件為數(shù)不多的高分子之一，并且由于其本身疏水，而又容易進行修飾而變得親水，所以其是原位植入高分子藥物釋放載體研究，應用究較多的一類高分子，包括微/納米球，纖維，凝膠等劑型［13－14］，這其中，脂肪族聚酯與聚乙二醇嵌段后可以制備成水凝膠［15－16］。本實驗制備了聚酯－聚乙二醇－聚酯型嵌段共聚物來形成凝膠，將藥物包裹在脂質體中后再包裹在其中，考察了紫杉醇在蛋白酶K 作用下的的釋放行為，實驗初步考察了載藥量和粒徑兩種處方因素和3 種不同的樣品，相關研究未見國內外文獻報道。

1 儀器與材料

1.1 儀器 掃描電子顯微鏡(飛利浦公司，日本);激光粒度測定儀(Beckman，德國);UV－230+紫外－可見檢測器，P－230 高壓恒流泵，EC2000 色譜處理工作站，EAST全自動交流穩(wěn)壓器(廣東易事特電源股份有限公司);色譜柱(Hypersil ODS，4.6 ×200，4.5 μm);Model100 柱溫箱(CBL Photoelectron Technology);JY96－Ⅱ超聲波細胞粉碎機(SCIENTZ，上海新芝生物技術研究所)，恒溫空氣浴搖床(HNY－100B 型，天津市歐諾儀器儀表有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(RE－53A 型，上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料 紫杉醇(＞98%，上海三維藥業(yè)有限公司)，注射用大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)有限公司)，丙交酯(山東岱罡公司)，乙交酯(山東岱罡公司)，雙端羥基聚乙二醇2000 (HO－ PEG－ OH，F(xiàn)luka 公司，質均分子量Mw =2000)，2－乙基己酸亞錫(＞95%，美國Sigma 公司產(chǎn)地日本)，乙酸乙酯，甲苯，乙醇(化學純，天津大茂化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津康科德試劑公司)，甲基叔丁基醚(分析純，國藥試劑沈陽分公司)，去離子水(1810－B 型石英自動雙重純水蒸餾器，江蘇金壇宏華儀器廠)。

2 方 法

2.1 薄膜水化－ 超聲法制備紫杉醇脂質體 參考文獻［4］210－213并根據(jù)預實驗結果確定紫杉醇脂質體處方及制備工藝。將紫杉醇0.75 g、注射用豆磷脂22 g、膽固醇0.56 g、溶解于乙醇中混合均勻后倒入茄形瓶，在30 轉/秒，60 ℃水浴條件下旋轉蒸干乙醇，使在玻璃瓶壁上形成干膜;將300 mL 去離子水溶液倒入茄形瓶中，在40 轉/秒，35 ℃條件下旋轉水化直至將瓶壁上的干膜完全洗脫下來為止，并將所得粗混懸液在室溫25 ℃條件下繼續(xù)水化1 h 得藥物含量約為2 mg/mL，得到白色的粒徑約為430 nm 的脂質體混懸液Ⅰ;將上述脂質體在功率60 w 的金屬探頭下超聲20 次，超聲時間2 s，間隔時間1 s，得到白色半透明的，含量約為2 mg/mL，粒徑約為90 nm 的脂質體混懸液Ⅱ;同樣地制備方法，豆磷脂和膽固醇量不變，但紫杉醇添加0.375 g，在上述同樣條件下超聲，最終得到藥物量約為1 mg/mL，粒徑約為80 nm 的脂質體混懸液Ⅲ?？梢钥闯?，處方中初步考慮了粒徑差別因素，同時考慮了載藥量因素，3 個處方特點分別為:Ⅰ的粒徑最大，Ⅱ和Ⅲ的粒徑較小且相近;載藥量設Ⅰ為1 個各單位的話，Ⅱ亦約1，Ⅲ約為1/2 (見圖1)。

將制備所得載藥脂質體涂抹于載玻片上形成一薄層，在無菌操作臺上自然風干，真空蒸鍍金后采用掃描電鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)脂質體呈現(xiàn)球形，采用軟件對其進行測量，發(fā)現(xiàn)其粒徑分布均勻。

2.2 溶液開環(huán)聚合法制備PLGA－PEG－PLGA 將15 g 的HO－PEG－OH 置于500 mL 反應瓶中與300 mL 甲苯共沸除水5 h 后，將無水乙酸乙酯中重結晶后的丙交酯11 g 與乙交酯3.5 g 置于其中，在氮氣氛圍下120 ℃加熱1 h 后使得體系混合均勻后，加入2 滴Sn (Oct)2后開始反應，12 h 后停止加熱，將甲苯略蒸除一些，直到體系變粘稠，將反應體系倒入冷凍的乙醚中，析出白色沉淀之后濾除溶劑再溶解入少量二氯甲烷中得稍粘稠溶液，將該液倒入至冷乙醚中再次析出產(chǎn)物，35 ℃真空干燥12 h 得白色粉末狀的PLGA－PEG－PLGA。

2.3 紫杉醇脂質體水凝膠的制備 精密稱取1.5 g 的PLGA－PEG－PLGA 于具塞玻璃試管中，滴加3 mL 去離子水使其初步溶漲得無載藥的白色均勻的半透明凝膠，分別精密量取所得3 種脂質體混懸液1、0.5、0.25 mL 滴入凝膠中，充分攪拌使溶解均勻，并最終均用去離子水調整至約5 mL，共得到9 種外觀均為白色均勻不透明的載藥脂質體凝膠。

將制備所得載藥脂質體凝膠涂抹于載玻片上形成一薄層，在無菌操作臺上自然風干，真空蒸鍍金后采用掃描電鏡進行觀察得圖2?？梢钥闯觯谀z的內部存在的球粒結構即脂質體，粒徑較大的脂質體置于凝膠中后其亦顯現(xiàn)較大粒子，較小粒徑的脂質體亦顯示小粒子;當脂質體在凝膠中的濃度比較大的時候，脂質體甚至聚集成團塊狀，當凝膠內部脂質體濃度較小時，可見顆粒狀結構［9］。

2.4 藥物釋放行為的考察

2.4.1 制劑中紫杉醇的含量及包封率測定 采用高效液相色譜(HPLC)測定制劑中紫杉醇的含量和包封率，參考文獻［6］177－187，HPLC 的條件如下。色譜柱:Dikma Diamonsil C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相:甲醇－ 水(體積比75∶25)，檢測波長:229 nm，流速1.0 mL·min－1，柱溫:25 ℃，進樣量:20 μL。此條件下，1 的保留時間為8.5 min。

［6］177－187，測定紫杉醇脂質體中藥物的包封率和載藥量。

包封率計算公式為:Encapsulation Efficiency = (paclitaxelaftercolumn/ paclitaxelbeforecolumn) × 100%

得3 種脂質體包封率分別為97.1%，93.1%，96.4%;載藥量分別為198.5、193.1、97.9 μg·mL－1。

脂質體凝膠中藥物的含量同上法并改進。將紫杉醇脂質體混懸液500 μL 加入5 mL 甲基叔丁基醚，渦旋振蕩2 min，2000 rpm 離心20 min，取3 mL 有機層氮氣吹干，用200 μL 流動相溶解后進行HPLC 測定，如有需要則用流動相稀釋至線性范圍內，結果見表1。

2.4.2 紫杉醇脂質體凝膠中藥物釋放曲線的繪制 在37℃的空氣浴搖床中，將3 mL 載藥脂質體凝膠放入具磨口塞的10 mL 平底玻璃試管中，加入3 mL 去離子水，搖床轉速為100 轉/分，進行藥物釋放實驗，在設計的時間0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7 h 取出全部3 mL 釋放介質后再加入3 mL 新的釋放介質。取出的釋放介質按2.4.1 項下處理后即注入HPLC 測定含量。

隨著載藥脂質體凝膠與釋放介質的接觸，釋放介質逐漸變渾濁，將其取出后可以測得其中含有1，隨著取樣的不斷進行，載藥脂質體凝膠層逐漸降解變得越來越少。紫杉醇的釋放行為如圖3，可知，釋放絕大部分的藥物釋放曲線行為均表現(xiàn)為0 級釋放動力學行為，引起0 級釋放的原因很多，比如高分子或脂質模塊的溶蝕，滲透泵制劑膜控制釋放等［17］，根據(jù)實驗觀察的現(xiàn)象本里例屬于前者。

表1 紫杉醇脂質體凝膠中脂質體加載體積和凝膠中最終藥物含量

表2 脂質體凝膠中紫杉醇釋放曲線的0 級擬合方程

如果脂質體攜帶著1 一同釋放入釋放介質，則粒子在凝膠中的穿行會表現(xiàn)出Peppas 方程式的形式而非0 級形式，但相關研究有待深入。此外，可以看出LH11 有酶和無酶組，LH21 有酶和無酶組，LH31 無酶組LH32 有酶組的釋放曲線在1～2 d 釋放速率較快，在2～5 d 釋放速率變慢，在5～7 d 釋放速率又變得較快，這些都通過相應階段釋放時間點所連成的直線斜率的比較可知。這種釋放模式在以往載藥聚酯水凝膠中報道過［15］155－163，初步分析原因可能為，水凝膠的隨著釋放介質對整個體系的較完全的浸泡和嵌段聚酯本身的降解，在釋放后期，這一點在脂質體濃度較高的凝膠中體現(xiàn)得尤為明顯。

3 討 論

3.1 以往文獻將紫杉醇包裹在脂質體中后再包裹進聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物即poloxamer188 的凝膠中，該種嵌段共聚物生物相容性較佳，但不可在體內生物降解，尤其是其包裹的脂質體釋放較快［9］1364－1369。本研究制備了生物可降解的常見的聚酯嵌段，保證了材料的生物降解性，并且采用了聚乙二醇將其連接，形成了親脂－親水－親脂型的結構，這保證了材料的成凝膠性。

3.2 PLGA－PEG－PLGA 中，實驗中亦制備了LA:GA =90:10 和LA:GA =50:50 時的聚酯，前者成結晶度較大的粉末狀，不容易水化且所得凝膠為不透明的白色固體，降解時間較長;后者呈現(xiàn)粘稠狀的微團塊，極易溶解在水中，溶解后呈現(xiàn)幾乎透明的凝膠，但降解時間較短，兩者在本實驗中均未采用。LA:GA=70:30 時，水化容易，所得凝膠半透明且降解時間適度。為制得LA:GA =70:30的聚酯嵌段，實驗中并未按照LA 與GA 的摩爾當量為7:3來進行，因為在甲苯溶液反應狀態(tài)下，GA 更容易開環(huán)聚合，這樣所得聚酯嵌段中GA 的含量可能偏高，在反應中多加入更多的LA 來解決此問題?；旌虾螅d藥脂質體在水凝膠中分布較均勻。

3.3 本實驗初步考察了兩個處方因素和3 種樣品，在本實驗設定的條件下，無論脂質體在凝膠中的不同包載密度，載藥量還是不同粒徑，紫杉醇的釋放均呈現(xiàn)緩釋特征。從Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ分別的釋放曲線可知，水凝膠中包載的脂質體量對紫杉醇釋放行為和速率無明顯影響，從Ⅱ和Ⅲ的釋放曲線比較可知，脂質體中紫杉醇的包裹量對其釋放行為及速率無明顯影響，說明只要粒子大小固定，其在水凝膠中的運動速率就固定。但是，脂質體的粒徑較大時，釋放速率及1 周后的釋放量稍小于較小粒徑脂質體，說明高分子水凝膠載體對大的粒子的運動有一定的阻礙作用，這可從Ⅰ和Ⅱ的釋放曲線比較看出。釋放曲線采用0 級釋放擬合回歸系數(shù)較高，雖然釋放介質中蛋白酶K 的存在可以加速紫杉醇的釋放，但其有無不影響藥物0 級釋放行為。所有樣品在1 周內釋放基本完全，關于紫杉醇的化療方案，國內現(xiàn)在較多用一周療法［3］66－72，本實驗中的釋放規(guī)律符合了這種要求。

圖1 掃描電子顯微鏡下混懸液Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ中脂質體粒徑的分布圖

圖2 掃描電子顯微鏡下紫杉醇脂質體凝膠的形貌

圖3 紫杉醇脂質體凝膠中藥物的釋放行為

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