張健，姜鑫，張洪亮

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院外科學(xué)教研室;2.濰坊市人民醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科，山東 濰坊 261042)

膝前交叉韌帶是正常膝關(guān)節(jié)活動(dòng)穩(wěn)定的重要解剖組織，ACL 斷裂是骨關(guān)節(jié)損傷中較為常見的一種，斷裂后極易引起膝關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定，繼而引發(fā)膝關(guān)節(jié)退行性變，導(dǎo)致膝骨性關(guān)節(jié)炎，嚴(yán)重影響膝關(guān)節(jié)的正常功能，建議及早手術(shù)修復(fù)。正常ACL 的腱－骨結(jié)合點(diǎn)是由四層典型結(jié)構(gòu)的直接止點(diǎn)組成，可分為肌腱、纖維軟骨帶、鈣化的軟骨和正常骨，這種解剖結(jié)構(gòu)起到傳遞、緩沖應(yīng)力的作用，而且在肌腱、韌帶的生長(zhǎng)及膠原重塑中起調(diào)控作用。肌腱與骨的愈合是較為復(fù)雜而緩慢的過程。纖維軟骨帶的形成是腱－骨愈合的特征性結(jié)構(gòu)，它的再生對(duì)腱－骨的愈合起著決定性作用。很多學(xué)者們意識(shí)到腱－骨愈合情況成為重建ACL 手術(shù)的焦點(diǎn)，因此如何促進(jìn)腱－骨愈合成為研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立兔ACL 斷裂重建動(dòng)物模型，將自體動(dòng)脈血離心得到的APRP 填充到ACL 重建的腱－骨界面中，分別在術(shù)后4、8、12 w 不同時(shí)間點(diǎn)取材行組織學(xué)觀察，并與對(duì)照組比較，在形態(tài)學(xué)上對(duì)腱－骨愈合進(jìn)行評(píng)估。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年新西蘭大白兔24 只，均4.5 月齡，體重2.8～3.3 kg，雌雄不限，由濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供，隨機(jī)分成兩組，每組各12 只(標(biāo)注):APRP組(于骨隧道腔中填充2 mL APRP+200 μL FG 凝膠);對(duì)照組(行單純的ACL 重建，骨隧道腔中200 μL FG)。

1.2 APRP 凝膠制備 參照改良的Landesberg 等［1］方法，每只成年白兔肌肉注射2.5 mg/kg 地西泮麻醉后，取兔耳背中央動(dòng)脈采集10 mL 全血，并標(biāo)注。采用二次離心法制備APRP，先將裝有10 mL 全血的離心管以2400 r/min 離心10 min，取得離心管上層的血漿和界面下3 mm 的血細(xì)胞層，重新置于1 支無菌離心管中以1400 r/min 離心20 min，去掉離心管上層全部血漿，得到底部約2 mL 的富血小板血漿。分別加入注射型生物蛋白膠(FG)200 μL、10%氯化鈣1.5 mL 與1000 U 的牛凝血酶(1000 U/支，凍干粉劑)混合，搖勻，形成具有固體強(qiáng)度的凝膠，放置并標(biāo)注，全部過程均在無菌條件下進(jìn)行，離心機(jī)內(nèi)的溫度恒定25 ℃，環(huán)境溫度常溫。

1.3 ACL 手術(shù)模型建立 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每只兔分別取后腿，術(shù)前備皮，術(shù)區(qū)消毒，鋪無菌洞巾，髕骨內(nèi)側(cè)取縱形切口，依次切開皮膚、皮下組織及關(guān)節(jié)囊，遂將髕骨推至外側(cè)，充分暴露兔膝關(guān)節(jié)腔，確定找出ACL，自上下止點(diǎn)處切斷，制備ACL 斷裂模型(圖1)。然后取兔后腿同側(cè)內(nèi)側(cè)肌群中游離并摘取半腱肌，剔除多余的肌肉部分，對(duì)折成雙股，兩端均用4－0 不可吸收線編織縫合。在兔脛骨側(cè)，用直徑2.0 mm 的克氏針自脛骨髁間嵴向ACL 上止點(diǎn)鉆取脛骨隧道，同克氏針，于股骨外側(cè)髁內(nèi)側(cè)面ACL 下止點(diǎn)向股骨外側(cè)髁外側(cè)面鉆取骨隧道，將編織好的肌腱分別穿經(jīng)脛骨和股骨隧道后于屈膝位30°拉緊(圖2)。實(shí)驗(yàn)組向骨隧道內(nèi)填充已制備好的APRP 凝膠，對(duì)照組骨隧道中只填充FG，將肌腱固定于周圍軟組織上，術(shù)后檢查前抽屜試驗(yàn)、Lachman 試驗(yàn)陰性后，生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合，無菌輔料包扎。術(shù)后分籠喂養(yǎng)，自由活動(dòng)，隔日換藥，5 d 內(nèi)青霉素注射液80 萬(wàn)U/d 肌注預(yù)防感染。觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)及傷口愈合情況。

1.4 標(biāo)本的制作 分別于術(shù)后4、8、12 w 時(shí)間利用空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，每組時(shí)間點(diǎn)分別處死4 只，摘取用做實(shí)驗(yàn)的膝關(guān)節(jié)，游離多余軟組織，制成骨－前交叉韌帶－骨標(biāo)本(圖3)。置于10%甲醛緩沖液固定，經(jīng)脫鈣、脫水透明、石蠟包埋，沿標(biāo)本縱軸面切片。分別行HE、VEGF免疫組織化學(xué)染色。VEGF 的檢測(cè)使用即用型免疫組織化學(xué)染色試劑盒(鼠抗兔，武漢博士德生物工程有限公司)，步驟按說明書進(jìn)行，鏡下觀察VEGF 的表達(dá)情況。利用FPAXMedview1.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)每張切片于在高倍視野(×400)下隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊視野進(jìn)行半定量測(cè)定VEGF免疫組織化學(xué)染色積分吸光度值(IA)，間質(zhì)及細(xì)胞質(zhì)顯示棕褐色均染或者顆粒均為陽(yáng)性細(xì)胞。每個(gè)標(biāo)本取切片2 張，計(jì)算平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 HE 染色觀察結(jié)果 術(shù)后4 wAPRP 組見肌腱與骨之間結(jié)合相對(duì)比較疏松，間隙大，其間填充的組織成分主要包括成纖維細(xì)胞、炎性細(xì)胞等，且局部少部分出現(xiàn)了不成熟的類軟骨細(xì)胞，細(xì)胞排列不規(guī)整。對(duì)照組見肌腱與骨之界面空隙較大，兩者之間填充含有血管的纖維結(jié)締組織成分，成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入腱組織中，并未見不成熟的類軟骨細(xì)胞。術(shù)后8 wAPRP 組見肌腱與骨連接不十分緊密，之間部分形成類軟骨細(xì)胞移行帶，類軟骨細(xì)胞排列尚整齊，少許新生骨組織向腱組織內(nèi)長(zhǎng)入。對(duì)照組見肌腱與骨之間大量成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維合成相對(duì)增多、排列方向不規(guī)整，腱－骨結(jié)合部連接開始變的緊密，部分腱骨界面出現(xiàn)膠原纖維連接。術(shù)后12 w 對(duì)照組見肌腱與骨之界面連接緊密，仍以膠原纖維連接為主，局部可見類軟骨細(xì)胞，排列相對(duì)較規(guī)則。APRP 組見肌腱與骨之間結(jié)合亦非常緊密，大量的膠原纖維合成，錨定于骨皮質(zhì)內(nèi)，膠原之間排列有成熟的軟骨細(xì)胞，腱－骨結(jié)合部出現(xiàn)膠原纖維－纖維軟骨－骨的移行帶改變，形態(tài)上接近于正常ACL 的直接止點(diǎn)樣結(jié)構(gòu)(見圖4－5)。

2.2 VEGF 免疫組織化學(xué) 術(shù)后4 w 的切片中，可見VEGF陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，APRP 組高倍鏡視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量高于對(duì)照組。術(shù)后8、12 w 時(shí)在腱骨交界，APRP 組VEGF 在高倍鏡視野下表達(dá)趨于下降，局限于成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，但仍多于對(duì)照組(見圖6)。

圖1 暴露兔ACL 并切斷

圖2 重建兔ACL

圖3 股骨前交叉韌帶—脛骨標(biāo)本

圖4 APRP 組不同周腱骨愈合情況 HE 染色×100

圖5 對(duì)照組不同周腱骨愈合情況 HE 染色×100

圖6 不同組VEGF 陽(yáng)性表達(dá)情況

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 術(shù)后4 w，APRP 組VEGF 表達(dá)與對(duì)照組有顯著性差異(P ＜0.01)，即表達(dá)增強(qiáng);術(shù)后8、12 w，APRP 組VEGF 表達(dá)與對(duì)照組有顯著性差異(P ＜0.01)，見表1。

表1 兩組標(biāo)本不同時(shí)間點(diǎn)VEGF 的表達(dá)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=4)

3 討 論

ACL 斷裂重建后自體半腱肌肌腱與骨隧道更早、安全有效的愈合對(duì)手術(shù)成功至關(guān)重要。正常的ACL 主要由膠原纖維與鈣化骨組織相連組成，解剖上可以分為4 個(gè)區(qū)域;韌帶、纖維軟骨、鈣化的纖維軟骨和骨［2］。研究表明ACL斷裂重建后可直接形成止點(diǎn)或間接止點(diǎn)［3］。間接的纖維連接與直接的纖維軟骨連接為腱－骨界面愈合提供了不同屬性。Rodeo 等人［4－5］研究發(fā)現(xiàn)，ACL 斷裂重建后腱－骨間最早形成纖維血管組織，然后肌腱內(nèi)開始長(zhǎng)入新生骨，并且腱－骨間生物力學(xué)功能的強(qiáng)度與新生骨長(zhǎng)入的深度呈正比關(guān)系。這就表明提高腱－骨間新生骨長(zhǎng)入能有效促進(jìn)腱－骨愈合。繼而形成接近于直接止點(diǎn)的結(jié)構(gòu)。因此，為了有效促進(jìn)腱－骨之間新生骨的長(zhǎng)入，有學(xué)者開始將各類細(xì)胞生長(zhǎng)因子應(yīng)用于促進(jìn)腱－骨愈合的修復(fù)領(lǐng)域［6－7］。

腱－骨界面的愈合是多種生長(zhǎng)因子綜合作用的結(jié)果，腱－骨間愈合過程中多種生長(zhǎng)因子在腱骨結(jié)合面生成［8－9］。APRP 含豐富的生長(zhǎng)因子，在腱－骨界面能釋放大量高濃度生長(zhǎng)因子［10－11］，主要包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子等。既有誘導(dǎo)成骨作用又不引起自身的免疫排斥反應(yīng)，具有促進(jìn)肌肉組織和骨組織愈合再生的功能［12］，且來源于自體動(dòng)脈血，采集方便，更安全，具有較廣的應(yīng)用前景。目前APRP 促進(jìn)腱－骨愈合的具體機(jī)制尚未完全明確，多種生長(zhǎng)因子間是否具有協(xié)同作用還是拮抗作用，具體是哪一種因子起主要作用等尚未解答。有學(xué)者［13］用自體半腱肌肌腱行ACL 斷裂后重建，一組單純ACL 重建，一組于脛骨骨隧道的腱－骨間隙填充轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子－β 與纖維蛋白粘合劑的復(fù)合物，一組只注入纖維蛋白粘合劑。重建后3 w，實(shí)驗(yàn)填充復(fù)合物組中腱－骨愈合界面的抗拉力優(yōu)于其它兩組，而其余兩組無明顯差別。Wang CJ［14］等通過建立ACL 重建模型，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白對(duì)腱骨愈合的影響。通過測(cè)骨密度、生物力學(xué)抗拉力研究、MRI 影像學(xué)分析、免疫組化等方法，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組結(jié)果發(fā)現(xiàn):骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因治療能夠顯著促進(jìn)腱－骨愈合，增加腱－骨界面的新生血管生長(zhǎng)和新骨的生成。Ma 等［15］在建立兔ACL 重建模型，通過研究不同劑量骨形態(tài)發(fā)生蛋白對(duì)腱－骨愈合的影響表明，新骨的形成及腱－骨界面的愈合均對(duì)劑量有依賴性。骨形態(tài)發(fā)生蛋白的實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組表現(xiàn)出更早的腱－骨愈合。YoshikawaT 等人［16］用羊重建ACL 模型，取羊自體的半腱肌代替前交叉韌帶。實(shí)驗(yàn)組的移植物用含有高濃度的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子溶液浸泡，對(duì)照組不做任何處理。結(jié)果顯示:術(shù)后12 w，實(shí)驗(yàn)組中腱－骨結(jié)合部新生血管數(shù)比對(duì)照組豐富，機(jī)械性能亦優(yōu)于對(duì)照組。并Ju YJ 等［17］應(yīng)用冰凍肌腱進(jìn)行ACL 重建，分為對(duì)照組:不作處理;磷酸鹽緩沖液組:向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入磷酸鹽緩沖液;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組:向膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):局部給予血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子明顯促進(jìn)冰凍移植肌腱的新血管再生，對(duì)重建交叉韌帶的血管再生具有促進(jìn)作用。Tohyama H 等［18］在ACL 重建術(shù)中應(yīng)用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，也得到相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。WeilerA 等在羊ACL 重建術(shù)中應(yīng)用血小板衍生生長(zhǎng)因子對(duì)移植物重塑的影響時(shí)發(fā)現(xiàn):血小板衍生生長(zhǎng)因子可以顯著提高移植肌腱的其抗拉能力。Li F等［19］探討應(yīng)用植入轉(zhuǎn)染血小板衍生生長(zhǎng)因子基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的滅活同種異體跟腱重建兔ACL，對(duì)照組移植物為單純滅活跟腱，細(xì)胞組移植物為種植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的滅活跟腱，基因組移植物為轉(zhuǎn)染基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞種植于滅活的跟腱。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染血小板衍生生長(zhǎng)因子基因的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有促進(jìn)重建韌帶血管化、加速韌帶成熟的作用。Nakase J 等［20］在兔子的脛骨近端與其長(zhǎng)軸垂直建立骨隧道，將兔的趾長(zhǎng)伸肌從股骨側(cè)起點(diǎn)切斷，斷端穿過脛骨隧道建立腱－骨愈合模型。實(shí)驗(yàn)組將脛骨隧道中的松質(zhì)骨用重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子溶液浸泡后填充于骨髓道中，對(duì)照組填充生理鹽水，術(shù)后比較兩組對(duì)腱－骨愈合的影響。結(jié)果顯示:應(yīng)用重組肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子能夠有效促進(jìn)腱－骨界面的愈合。

APRP 是通過二次離心自體全血而獲得的高濃縮血小板的血漿，其中含有豐富大量高濃度的生長(zhǎng)因子，且各生長(zhǎng)因子的比例是機(jī)體自身形成的。但若局部單純應(yīng)用某種生長(zhǎng)因子，其半衰期較短、極容易降解和被血液循環(huán)稀釋，不能有效的在局部形成并保持長(zhǎng)時(shí)間的有效濃度。因此APRP 作為各類生子因子的聯(lián)合使用必能促進(jìn)移植物更早、安全可靠的生長(zhǎng)愈合，確保能形成長(zhǎng)時(shí)間并高效的治療目的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:APRP 組各時(shí)間點(diǎn)腱－骨界面的愈合均較對(duì)照組更早，8 w 時(shí)已可見較規(guī)則軟骨細(xì)胞移行帶，12 w 時(shí)即可見正常ACL 典型的四層解剖結(jié)構(gòu)，形成類似于正常直接止點(diǎn)，并可見纖維軟骨形成，新生骨組織向肌腱內(nèi)長(zhǎng)入，之間結(jié)合緊密，說明APRP 有利于ACL 斷裂重建后腱－骨界面形成直接止點(diǎn)。

目前APRP 應(yīng)用到臨床方面依然尚存諸多亟待解決的問題:首先，APRP 的制備于國(guó)內(nèi)外目前尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，如何建立高效和穩(wěn)定的APRP 制備方法，怎樣提供專門的、經(jīng)國(guó)家有關(guān)部門批準(zhǔn)檢驗(yàn)的、無菌要求合格的質(zhì)量保證，成為當(dāng)前我們有待解決的難題。其次，采用不同方法制作的APRP 會(huì)引起血小板破壞多、提取純度不夠，使得APRP中各類生長(zhǎng)因子濃度存在差異，及各種因子的活性、生物學(xué)作用機(jī)制不詳。第三，APRP 當(dāng)前主要集中應(yīng)用在口腔頜面部及顱骨小范圍缺損的研究，由于目前APRP 促進(jìn)腱－骨愈合的研究尚停留于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究階段，仍需建立更加可靠、可重復(fù)的動(dòng)物模型，來進(jìn)一步設(shè)計(jì)更嚴(yán)格、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用于臨床仍需要長(zhǎng)期的不懈努力與艱苦的探索。

［1］Landesberg R，Boy M，Olicknum RS.Quantification of growth factor levels using a simplified method of platelet－ rich plasma gelpreparation ［J］.J Oral Maxillofac Surg，2000，58 (3):297－300.

［2］Petersen W，Laprell H.Insertion of autologous tendon grafts to the bone:a Histological and immunohistochemical study of hamstring and pateller tendon grafts ［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2000，8 (1):26－31.

［3］Strobel MJ，Schulz MS.Anterior cruciate ligament reconstruction with the semitendinosus－ gracilis tendon transplant ［J］.Orthopade，2002，31 (8):758－769.

［4］Rodeo SA，Arnoczky SP，Torzilli Pa，et al.Tendonhealing in a bone tunnel.A biomechanical and histological study in the dog［J］.J Bone Joint Surg (Am)，1993，75 (12):1795－1830.

［5］Chen CH.Gr aft healing in anterior cruciate ligamentreconstruction［J］.Sports Med Arthrosc RehabilT her Technol，2009，1(1):21.

［6］Mur ray MM，Spindler KP，Abreu E，et al.Collagenplateletrich plasma hydrog el enhances primary repairof the porcine anterior cruciate ligament ［J］.J OrthopRes，2007，25 (1):81－91.

［7］Sanchez M，Azofr a J，Anitua E，et al.Plasma rich ingrowth factors to treat an articular cartilag eavulsion:a case report［J］.MedSciSports Exerc，2003，35 (10):1648－1652.

［8］Anderson K，Seneviratne AM，Izawa K，et al.Augmentation oftendon healing in an intraarticular bone tunnel with use of a bone growth factor ［J］.Am J Sports Med，2001，29 (6):689－698.

［9］Yamazaki S Yasuda K，Tomita F.The effect of transforming growth factor－betal on intraosseous healing of flexor tendon autograft replacement to anterior cruciate ligament in dogs ［J］.Axthroscopy，2005，21 (9):1034－1041.

［10］Yuan T，Zhang C，Zeng B.Treatment of chronic femoral osteomyelitis with platelet－ rich plasma (PRP ):a case report［J］.Transfus Apher Sci，2008，38 (2):167－173.

［11］Pietramaggiori G，Scherer SS，Mathews JC，et al.Healing modulation induced by freeze－dried platelet－rich plasma and micronized allogenic dermis in a diabetic wound model ［J］.Wound Repair Regen，2008，16 (2):218－225.

［12］Gamradt SC，Rodeo SA，Warren RF.Platelet rich plasma in rotator cuff repair ［J］.Tech Orthop，2007，22 (1):26－33.

［13］Yamazaki S，Yasuda K，Tomita F，et al.The effect of transforming growth factor－ betal on intraosseous healing of flexor tendon auto－ graft replacement of anterior cruciate ligament in dogs ［J］.Arthroscopy，2005，21 (9):1034－1041.

［14］Wang CJ，Weng LH，Hsu SL，et al.pCMV－ BMP－ 2－transfected cell－mediated gene therapy in anterior cruciate ligament reconstruction in rabbits ［J］.Arthroscopy，2010，7:968－976.

［15］Ma CB，Kawamura S，Deng XH，et al.Bone morphogenetic proteins signaling plays a role in tendon－to－bone healing:a study of rhBMP－2and noggin ［J］.Am J Sports Med，2007，35 (4):597－604.

［16］Yoshikawa T，Tohyama H，Katsura T，et al.Effects of local administrationof vascular endothelial growth factor on mechanical characteristics of the semitendinosus tendon graft after anterior cruciate ligament reconstruction insheep ［J］.Am J Sports Med，2006，12:1918－1925.

［17］Ju YJ，Tohyama H，Kondo E，et al.Effects of local administration of vascular endothelial growth factor on properties of the in situ frozenthawed anterior cruciate ligament in rabbits ［J］.Am J Sports Med，2006，1:84－91.

［18］Tohyama H，Yoshikawa T，Ju YJ，et al.Revascularization in the tendon graft following anterior cruciate ligament reconstruction of the knee:its mechanisms and regulation ［J］.Chang Gung Med J，2009，2:133－139.

［19］Li F，Jia H，Yu C.ACL reconstruction in a rabbit model using irradiated achilles allograft seeded with mesenchymal stem cells or PDGF－ B gene－ transfected mesenchymal stem cells［J］.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，2007，10:1219－1227.

［20］Nakase J，Kitaoka K，Matsumoto K.Facilitated tendon－bone healing by local delivery of recombinant hepatocyte growth factor in rabbits ［J］.Arthroscopy，2010，1:84－90.