王鳳飚

(天津市第四中心醫(yī)院肝膽外科，天津 300140)

膽囊癌是膽道系統(tǒng)疾病常見(jiàn)的惡性腫瘤，以浸潤(rùn)型多見(jiàn)［1］。該病惡性程度較高，容易發(fā)生侵犯、轉(zhuǎn)移。膽囊癌的早期癥狀極不典型，有類似膽囊炎癥狀，無(wú)特異性臨床癥狀造成膽囊炎早期診斷率低，而延誤治療，手術(shù)難以根治、復(fù)發(fā)率高［2］。目前，研究顯示膽囊粘膜在長(zhǎng)期炎癥環(huán)境中可向惡性轉(zhuǎn)化的，從現(xiàn)有的對(duì)于炎癥相關(guān)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究來(lái)看，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為局部炎癥造成免疫反應(yīng)是影響腫瘤的主要機(jī)制［3］。這一機(jī)制重要的是尤其是以T 淋巴細(xì)胞受體復(fù)合物TLR4 有所表達(dá)，COX－2 在消化系惡性腫瘤中作用已得到研究證實(shí)，本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)3 組組織TLR4、COX－2 表達(dá)以探討其在膽囊癌發(fā)病中的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009 年1 月至2012 年10 月我院肝膽外科收治手術(shù)的膽囊疾病患者60 例組織標(biāo)本，其中20 例正常膽囊組織(A 組)取自因壺腹部腫瘤行胰十二指腸切除術(shù)患者，均無(wú)膽囊炎及膽囊結(jié)石病史，男性14 例，女性6 例，年齡35～62 歲，平均年齡(56 ±2)歲;慢性膽囊炎20 例(B 組)，男14 例，女6 例，年齡26～85 歲，膽囊癌20 例(C 組)，男性12 例，女性8 例，年齡35～78 歲，平均年齡51 歲。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅱ期10 例，Ⅲ期6 例，Ⅳ期4 例，腫瘤患者術(shù)前均未接受化療及放療。所取標(biāo)本一部分4%福爾馬林浸泡后常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，其余部分液氮快速凍存?zhèn)溆谩? 組患者年齡、性別等無(wú)顯著性差異(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片 經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇水化，蒸餾水沖洗后，加入檸檬酸鹽緩沖液，煮沸，20 min 后，抗原熱修復(fù)后，將含有山羊血清的PBS 液置于室溫15 min 封閉后。分別滴加兔抗人(TLR4、COX－2)一抗(1∶100 濃度)，4℃內(nèi)放置8～12 h。陰性對(duì)照以PBS (含普通山羊血清)代替一抗。PBS 沖洗后加羊抗兔二抗(1∶200 濃度)，在37℃育1 h。以DAB)液進(jìn)行顯色后，浸入蘇木素中，清水漂洗0.5 h，再行脫水和二甲苯透化，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察各個(gè)標(biāo)本石蠟切片的免疫組化染色。

1.2.2 結(jié)果判斷 (TLR4、COX－2)的陽(yáng)性顆粒在細(xì)胞核中出現(xiàn)為棕黃色顆粒即為陽(yáng)性細(xì)胞。綜合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍，對(duì)TLR4、COX－2 的表達(dá)進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度:基本未著色、染色與背景相似者為0 分，著色淺、略高于背景者為1 分，中度著色明顯高于背景者為2 分，強(qiáng)染、著色深棕色者為3 分;陽(yáng)性范圍:＜10%為0 分，10%～24%為1 分，25%～49%為2 分，50%～75%為3 分， ＞75%為4 分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性范圍相加，≥2 分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

3 組患者組織中的TLR4 與COX－2 的表達(dá)水平比較，見(jiàn)表1。

表1 3組患者組織中的TLR4 與COX－2 的表達(dá)水平比較()

3 討 論

膽囊癌是起源于膽囊上皮細(xì)胞的腫瘤，其目前的治療手段不能提高其治療后生存率。惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的各系統(tǒng)參與作用的結(jié)果，眾多治療能干預(yù)其環(huán)節(jié)就能夠通過(guò)連鎖效應(yīng)改變病變的進(jìn)程及結(jié)果［4］。因此，找尋這一重要環(huán)節(jié)顯得極為重要，本研究基于膽囊癌與炎癥環(huán)境之間的關(guān)系來(lái)進(jìn)行探討TLR4、COX－2 兩個(gè)重要基因進(jìn)行比較，來(lái)證實(shí)兩者表達(dá)及相關(guān)性問(wèn)題，有益于臨床早期診斷及治療。不同的Toll 樣受體通過(guò)識(shí)別不同病原體來(lái)發(fā)生作用，TLRs 通過(guò)識(shí)別不同的病原體并結(jié)合，激活先天性免疫系統(tǒng)，還有研究顯示，部分TLR4 可在惡性腫瘤中表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［5］。環(huán)氧合酶－ 2(COX－2)能夠?qū)⒒ㄉ南∷徂D(zhuǎn)化為前列腺素，并且是這一過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶。COX－2 是誘導(dǎo)酶的一種，平時(shí)不表達(dá)［6］，當(dāng)機(jī)體在炎癥、毒素、致癌等因素作用下出現(xiàn)高表達(dá)，這一情況已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可。本研究顯示3 組患者組織中的TLR4 與COX－ 2 的表達(dá)水平比較 (t = 5.21、5.11、6.13，F(xiàn)=4.02，P ＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，3 組患者組織中的TLR4 與COX－2 的表達(dá)呈正相關(guān)(P ＜0.05)。因此推論出，TLR4 基因能夠激發(fā)COX－2 的表達(dá)并呈正相關(guān)，TLR4 信號(hào)通路在免疫系統(tǒng)中處于中心地位，當(dāng)膽囊組織受到內(nèi)毒素LPS 及一些細(xì)胞因子的刺激下，免疫系統(tǒng)被激活，導(dǎo)致復(fù)合物被磷酸化激活后，同COX－2結(jié)合產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。因此有理由相信通過(guò)TLR4 促進(jìn)COX－2 表達(dá)可能是膽囊癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)［7］。

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［4］Horn T，Boutros M.E－RNAi:a web application for the multispecies design of RNAi reagents ［J］.Nucleic Acids Res，2010.

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