王 楊，高 輝，黃云昆，付曉野，彭傳梅

（昆明市延安醫(yī)院 檢驗科，云南 昆明650051）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa，PA）廣泛分布于自然界，屬于條件致病菌，是醫(yī)院感染常見的多重耐藥病原菌之一。細菌對新型廣譜β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的主要機制之一是其產(chǎn)生了一種超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（extended－spectrumβ－lactamases，ESBLs），ESBLs有較廣的水解底物譜，能滅活多種抗生素，導致細菌多重耐藥，該酶按Ambler分類屬于A類，按Bush分類法屬于2be群，其基因型主要分為：TEM型、SHV型、OXA型、CTX－M型和其它型（如：PER型、VEB型、BES型等），不同基因型的ESBLs有各自的優(yōu)先水解底物，不同國家、地區(qū)產(chǎn)ESBLs細菌的流行情況存在著較大的差別［1－3］。

該研究收集2009－2012年昆明3所三甲醫(yī)院臨床標本中分離的110株P(guān)A，通過研究其ESBLs基因型分布情況，為進一步研究昆明地區(qū)PA耐藥基因的分布情況奠定基礎，為減少耐藥PA的產(chǎn)生、提高臨床抗感染治療效果提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2009年6月－2009年10月昆明地區(qū)3所三甲醫(yī)院臨床標本中分離的非重復PA 110株，分別為昆明市延安醫(yī)院60株、昆明醫(yī)科大學附屬一院20株、昆明醫(yī)科大學附屬二院30株。藥敏試驗質(zhì)控菌株：大腸埃希菌（ATCC25922）和銅綠假單胞菌（ATCC27853），由云南省臨檢中心提供，TEM基因陽性對照DNA由浙江大學醫(yī)學院俞云松教授惠贈。

1.2 儀器和試劑

VITEK32型自動細菌鑒定儀及革蘭陰性桿菌鑒定卡（法國生物梅里埃公司）；基因擴增儀（德國Biometra公司）；Power Pac Basic電泳儀和Laboratovies 6000凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio－Rad公司）。細菌基因組提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；PCR擴增試劑盒（Taq PCR MasterMix）購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；PCR擴增引物由invitrogen公司合成。

1.3 細菌鑒定

用VITEK32自動細菌鑒定儀革蘭陰性鑒定卡進行菌種鑒定。

1.4 提取細菌基因組DNA

用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，按試劑盒說明書操作。

1.5 基因檢測

采用PCR法擴增7種ESBLs基因，7種靶基因引物序列見表1［4］。PCR 擴增體系均為：10xEx Taq Buffer 2μl，模板0.5μl，P1引物0.8μl，P2引物0.8μl，dNTP 1.6μl，Ex Taq0.2μl，ddH2O 14.1 μl。熱循環(huán)參數(shù)均為：94℃2min，然后94℃60s→55℃60s→72℃60s，循環(huán)35個周期，最后72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色，Bio－Rad Laboratories 6000凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，并攝像保存。PCR產(chǎn)物與購自上海美季生物技術(shù)有限公司的DNA分子量標準（DL2000）對比，出現(xiàn)相應長度目的條帶即為陽性。

表1 PCR引物序列

1.6 基因序列測定與分析

ESBLs基因擴增的陽性產(chǎn)物經(jīng)純化后，送北京博邁德科技發(fā)展有限公司用美國應用生物系統(tǒng)公司ABI 377型全自動DNA序列分析儀進行序列測定，所測序列參照美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）的 BLAST 進行序列比對和同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 細菌鑒定結(jié)果

結(jié)果表明，昆明地區(qū)3所三甲醫(yī)院臨床標本中分離的110株非重復性細菌均為PA。

2.2 ESBLs基因PCR檢測結(jié)果

110株P(guān)A中7種ESBLs基因TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX－M－1 均 有 檢 出，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 7種ESBLs基因擴增產(chǎn)物電泳圖

2.3 110株P(guān)A中ESBLs基因型的分布

110株P(guān)A中ESBLs基因型的檢測結(jié)果，見表2。

表2 110株P(guān)A中7種ESBLs基因型的分布

2.4 序列分析及比對

本研究隨機選取24個菌株的TEM基因、1個菌株的SHV基因、5個菌株的OXA基因、3個菌株的PER基因、3個菌株的VEB基因、1個菌株的GES基因和8個菌株的CTX－M－1基因PCR陽性產(chǎn)物進行雙向測序，分別測得523、786、822、978、961、846、833個核苷酸。經(jīng)分析，測得序列與Gen－Bank DNA序列數(shù)據(jù)庫里的 TEM、SHV、OXA、PER、VEB、GES、CTX－M－1型 ESBLs編碼基因的同源性均為98%以上。

3 討論

近年來，研究者們在PA中發(fā)現(xiàn)了多種ESBLs，美國流行的ESBLs基因型以TEM－10、TEM－12型為主，在歐洲SHV型較常見，在亞洲流行的CTXM 型 中，以 CTX－M－14和 CTX－M－3居 多［2－4］，我 國以CTX－M型較多見［5］。國內(nèi)各地區(qū)對銅綠假單胞菌ESBLs檢出率和基因分型有較大的差別，北京常東等對PA的研究發(fā)現(xiàn)，TEM、OXA、PER、GES的陽性率分別為51.4%、42.8%、31.4%、22.9%，而SHV、VEB和 CTX－M 基因均未檢出［4］；河北侯天文等研究的PA中ESBLs檢出率為34.1%，流行的基因型主要是PER型，未檢出SHV和OXA型［6］；上海蔣曉飛等研究者發(fā)現(xiàn)36株多重耐藥PA中有34株ESBLs，檢出TEM、OXA和VEB型三種基因型，VEB－3是其流行的主要基因型，未檢出SHV、CTX和PER型［7］。浙江地區(qū)李超等研究的PA中流行的ESBLs基因型別主要是TEM型［8］。

本研究發(fā)現(xiàn)，昆明地區(qū)3所醫(yī)院臨床分離的110株P(guān)A中7種主要的超廣譜β－內(nèi)酰胺酶基因型（PER、VEB、GES、TEM、SHV、OXA、CTX－M）均有檢出，顯示110株臨床分離PA中ESBLs基因型別分布較廣，其中，附二院共檢出6種ESBLs基因型，附一院共檢出5中基因型，延安醫(yī)院檢出4種基因型，且3所醫(yī)院都存在同一菌株攜帶多種耐藥基因的情況，PA中流行的ESBLs基因型別主要是TEM型（占77.3%）。研究結(jié)果顯示，昆明3所醫(yī)院PA中ESBLs基因的流行情況與上述北京、河北、上海地區(qū)研究者的研究結(jié)果存在差別，而與浙江地區(qū)李超等的研究結(jié)果相似。

TEM型ESBLs是細菌在新一代抗生素選擇性壓力等因素的影響下，其β－內(nèi)酰胺酶基因發(fā)生突變而生成的衍生酶，它有較廣的水解底物譜，能水解廣譜青霉素、第三代頭孢類及單環(huán)類抗生素［9－11］。造成菌株ESBLs攜帶情況差異的原因可能與菌株來源（地理位置）和各地區(qū)醫(yī)院抗菌藥物的使用習慣不同有關(guān)，也可能與各醫(yī)院住院病人數(shù)量的差異、病人來源的復雜程度和病種類型的多樣性等相關(guān)。動態(tài)聯(lián)合監(jiān)測當?shù)豍A的耐藥率及耐藥基因流行情況，對于及時發(fā)現(xiàn)突變株，指導臨床科學合理地使用抗生素，預防和控制院內(nèi)感染的流行具有重要意義。

致謝：本研究的菌株收集工作得到了昆明地區(qū)兄弟醫(yī)院的鼎力相助，在此，課題組謹向昆醫(yī)附一院、昆醫(yī)附二院細菌室各位領導和工作人員表示衷心的感謝！

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