朱 杰，趙成艷，王 敏，高艷飛，常青燕

（1.大連醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連116027；2.遼河油田第二醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 盤錦124000；3.大連市第六人民醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連116021）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性惡性漿細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）在骨髓中異常增殖，并伴有單克隆免疫球蛋白（monoclonal immunoglobulin）增多為特征的疾?。?］，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。特點(diǎn)是單克隆的漿細(xì)胞在骨髓中異常增殖（可達(dá)骨髓內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的90%），破壞骨髓造血功能并分泌單克隆免疫球蛋白或或其多肽鏈亞單位（如輕鏈，light chain，L），并通過多種機(jī)制產(chǎn)生臨床癥狀及體征。多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為骨髓瘤細(xì)胞增生、浸潤(rùn)和破壞骨組織及髓外其他組織，出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、貧血、出血，以及骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白而出現(xiàn)感染、高鈣血癥、腎臟病變、高粘滯血癥、淀粉樣變等，尤其在疾病早期，表現(xiàn)無特異性，極易漏診和誤診，延誤治療、錯(cuò)誤治療增加患者痛苦。國(guó)內(nèi)一般通過三色流式細(xì)胞術(shù)來對(duì)MM患者的骨髓細(xì)胞進(jìn)行免疫表型特點(diǎn)的研究，而本實(shí)驗(yàn)是通過四色流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行免疫表型分析，以期望為MM的診斷提供高可靠的依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

樣本來源：2011年1月至2011年12月大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院住院MM患者45例，其中女性12例，男性33例，中位年齡60歲；均為初診患者，骨髓細(xì)胞學(xué)檢查瘤細(xì)胞占（15－95%），其中分泌型為37例（IgG型為27例，IgA型為10例）輕鏈型為5例（λ鏈型4例，κ鏈型1例），不分泌型3例。

1.2 儀器

流式細(xì)胞儀：FACSCalibur美國(guó)BD公司。

1.3 試劑

CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、 CD138－PE、CD45－APC、κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、κ－FITC／λ－PE、IgG2a－FITC、IgG1－PE，溶 血 素、破 膜劑，以上試劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4 標(biāo)本的采集

無菌操作抽取0.2ml骨髓液涂片作顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查。另抽取2ml置于EDTA－K2抗凝血常規(guī)管作免疫分型，6h內(nèi)完成檢驗(yàn)。

1.5 標(biāo)本的處理

骨髓涂片行瑞氏－吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并分類計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞?？鼓墓撬枰簂 ml，加3 ml PBS液，混勻后，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)，調(diào)節(jié)至5×106／ml，制成細(xì)胞懸液備用。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 胞膜的標(biāo)記及胞漿內(nèi)輕鏈的標(biāo)記

（1）胞膜的標(biāo)記：每管100μl細(xì)胞懸液分別加入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE、CD45－APC）、（CD38－FITC ／CD56－PE／CD19－Percp、 CD45－APC ）、（CD138－PE、CD45－APC）、（κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、CD45－APC）各20μl，混勻避光15min，加配置好的溶血素2ml，避光10min，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

（2）胞漿內(nèi)輕鏈的標(biāo)記：取兩只試管，每管100 μl細(xì)胞懸液分別加入 CD45－APC 20μl，避光15 min，再加入破膜劑A液100μl，避光10min，加溶血素2ml，避光10min，在水平離心機(jī)上離心（1 500 r／min，5min），棄去上清液，加入溶血素B液50μl，分 別 加 入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE）、（κ－FITC／λ－PE），避光15min，加2ml PBS洗滌，在水平離心機(jī)上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

1.6.2 流式細(xì)胞儀測(cè)定

用熒光微球校準(zhǔn)儀器及補(bǔ)償后，用Cellquset軟件收取10000個(gè)細(xì)胞，通過CD45／SSC和CD38／CD56聯(lián)合設(shè)門，確定瘤細(xì)胞的位置及抗原表達(dá)情況。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)抗體陽性率＞20%為陽性，反之陰性。

2 結(jié)果

2.1 免疫表型的檢測(cè)結(jié)果

每例標(biāo)本先在CD38／CD56圖中確定瘤細(xì)胞（CD38＋CD56＋或 CD38＋CD56－細(xì)胞群），然后在CD45／SSC圖中標(biāo)記其瘤細(xì)胞位置，并根據(jù)此圈定瘤細(xì)胞群并設(shè)門，為以后的各圖分析做好準(zhǔn)備，其瘤細(xì)胞比率占10.56%－75.45%，平均35.23%。見圖1和圖2、圖3和圖4。

圖1 中R1群為CD38＋CD56＋細(xì)胞群，在圖2中（CD45／SSC）表現(xiàn)為R3的位置為CD45－。圖3R1群為CD38＋CD56－細(xì)胞群，在CD45／SSC圖4中表現(xiàn)為R3的位置為CD45－。

2.2 多發(fā)性骨髓瘤瘤細(xì)胞免疫表型及胞漿輕鏈表達(dá) 見表1。

其中輕鏈型胞漿內(nèi)輕鏈的表達(dá)類型與血清蛋白電泳表達(dá)的完全一致。

表1 多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞免疫表型及胞漿輕鏈的表達(dá)

3 討論

關(guān)于瘤細(xì)胞的比率的問題，在骨髓片中的人工計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞儀的計(jì)數(shù)中，由于留給做流式細(xì)胞術(shù)的骨髓液中常?；煅某潭却笥诠撬杓?xì)胞學(xué)的人工計(jì)數(shù)的骨髓片，而且程度不一，所以無法比較二者的關(guān)系。

臨床上，診斷多發(fā)性骨髓瘤（MM）一般根據(jù)骨髓細(xì)胞學(xué)和應(yīng)用免疫學(xué)方法分析檢測(cè)血和尿的異常M蛋白及輕鏈。然而，有時(shí)形態(tài)學(xué)偏成熟的骨髓瘤細(xì)胞與正常的漿細(xì)胞在形態(tài)上難以區(qū)分。而采用免疫分型法對(duì)MM進(jìn)行分析，是使之有效的方法。文獻(xiàn) 報(bào) 道［2，3］正 常 的 漿 細(xì) 胞 表 達(dá) CD38＋、CD19＋、CD138＋、CD56－。我們對(duì)45例MM 患者的檢測(cè)結(jié)果表明：典型的骨髓瘤細(xì)胞免疫表型為CD45－／±、CD38＋、CD56＋／－、CD138＋、cκ＋／－或 cλ＋／－、CD56＋／－，而CD19－。

Van Camp等［4］報(bào)道多數(shù) （43／55，78%）MM患者有CD56＋表達(dá)，而正常漿細(xì)胞沒有CD56的表達(dá)。因此，有的人認(rèn)為CD56是區(qū)分正常與惡性漿細(xì)胞的重要標(biāo)志之一［5］。我們檢測(cè)的結(jié)果與Van Camp的相似，但CD56＋的細(xì)胞占（87%，39／45），比報(bào)道高。因此提示，雖然CD56是區(qū)分正常與惡性漿細(xì)胞的重要標(biāo)志，CD56陽性有助于MM 的診斷，但CD56陰性不能除外MM的診斷，還應(yīng)該結(jié)合其它特性進(jìn)行綜合分析，這與黃春妮等人［6］的觀點(diǎn)一致。

CD19是包括正常漿細(xì)胞在內(nèi)的B細(xì)胞系的一個(gè)重要標(biāo)志，但在我們檢測(cè)的45例MM標(biāo)本中，無一例細(xì)胞具有 CD19＋表征，Adam［7］，Harada［8］，Ely SA［9］也表明CD19在MM中幾乎不表達(dá)。因此，應(yīng)用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)，根據(jù)特定細(xì)胞群CD56和CD19表型可以明確MM骨髓中瘤細(xì)胞的負(fù)荷量。本文中6例CD56MM中，3例為輕鏈型，3例為不分泌型，并且臨床表現(xiàn)較一致，均是外周血三系減少的病例，那么CD56－是否與疾病的不良過程有關(guān)，因本文的病例較少，需要長(zhǎng)期的臨床觀察。

CD38：研究表明CD38是NAD糖基水解酶，與細(xì)胞增殖和激活有關(guān)。在人的正常骨髓中，無論是髓系或B淋巴系前體細(xì)胞以及成熟的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞，CD38均有不同程度的表達(dá)，但僅在漿細(xì)胞表面可被檢測(cè)到超強(qiáng)表達(dá)，被認(rèn)為是特異性的漿細(xì)胞表面標(biāo)志［10］。CD38與多發(fā)性骨髓瘤的瘤細(xì)胞關(guān)系最為密切，常被用作骨髓瘤細(xì)胞的鑒定指標(biāo)，一般認(rèn)為，CD38在穩(wěn)定期仍高表達(dá)，表明穩(wěn)定期中雖然患者的臨床癥狀有所改善，骨髓中漿細(xì)胞比例恢復(fù)正常，但腫瘤克隆細(xì)胞仍沒有被完全清除［11］。

CD45：即白細(xì)胞分化抗原，是單鏈跨膜糖蛋白，屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成員，它廣泛地存在于除了成熟紅細(xì)胞和血小板之外所有的造血系細(xì)胞表面，在淋巴細(xì)胞的發(fā)育激活中起重要作用。其廣泛表達(dá)于漿細(xì)胞表面，而在MM細(xì)胞中呈陰性或弱陽性表達(dá)。CD45是近期骨髓瘤免疫表型研究的一個(gè)新的熱點(diǎn)，CD45設(shè)門常被應(yīng)用到MM的流式免疫分型中，但近年來發(fā)現(xiàn)［12］有相當(dāng)比例的MM病人可監(jiān)測(cè)到CD45高強(qiáng)度表達(dá)，而幾乎所有的MM患者均含有一小群有增殖活性的漿細(xì)胞，此類細(xì)胞的表型特點(diǎn)為CD45強(qiáng)陽性，因此目前多結(jié)合CD138或CD38等其他表型抗原設(shè)門來提高流式免疫分型檢測(cè)的精確性。

CD138：Syndecan－1分子，屬于黏附分子跨膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員，其表達(dá)具有細(xì)胞類型和發(fā)育階段的特異性，它們可以參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附等多種功能，并與腫瘤細(xì)胞的歸巢及轉(zhuǎn)移等過程有關(guān)。CD138特異的表達(dá)于漿細(xì)胞，許多學(xué)者如河南鄭州的張琦［13］認(rèn)為幾乎所有的MM患者均表達(dá)CD138，且不會(huì)在骨髓造血前體細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上表達(dá)，因此，被認(rèn)為是骨髓瘤細(xì)胞最特異的表面標(biāo)志，丁潤(rùn)生等人［14］曾報(bào)道多發(fā)性骨髓瘤的漿細(xì)胞主要表達(dá)CD138，并證明多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞CD138表達(dá)水平高于正常漿細(xì)胞，認(rèn)為CD138陽性細(xì)胞即為骨髓瘤細(xì)胞。Garcia［15］，秦燕［10］等曾證實(shí) MM 患者骨髓瘤細(xì)胞CD138陽性率幾乎達(dá)到100%。這些都證實(shí)了CD138為MM細(xì)胞最特異的表面標(biāo)志。

本文中所有的 MM 中，全部表達(dá)CD138，但CD38、CD138表達(dá)并不特異，良性漿細(xì)胞亦有表達(dá)，故CD38、CD138可以作為骨髓瘤篩選和純化標(biāo)志。由于CD138在骨髓瘤細(xì)胞的廣泛表達(dá)，是抗骨髓瘤靶向治療的理想的作用位點(diǎn)?？梢哉J(rèn)同以往的學(xué)者的觀點(diǎn)，即針對(duì)CD138抗原的單抗是一個(gè)有效的抗骨髓瘤的藥物。

檢測(cè)胞漿輕鏈判斷骨髓瘤細(xì)胞的克隆性具有高度的可靠性，張琦［13］認(rèn)為一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆在其一生中僅僅產(chǎn)生兩型輕鏈中的一型，我們稱其為輕鏈的同型排斥，鑒于其克隆的獨(dú)特性，輕鏈的表達(dá)可以作為B系腫瘤的克隆增殖標(biāo)志，因此如果所有B細(xì)胞的損害表現(xiàn)為輕鏈的單一表達(dá)，該腫瘤就很可能是單克隆的，相反的，如果兩種輕鏈數(shù)目接近于相等，則可能為多克隆的。胞漿輕鏈的檢測(cè)對(duì)于某些特殊類型的骨髓瘤的診斷是必須的，輕鏈型骨髓瘤細(xì)胞只分泌一種輕鏈，由于輕鏈的分子量很小，血清中檢測(cè)不到，因此胞漿輕鏈的檢測(cè)對(duì)確診起到不可忽視的作用，它也可用于意義未明的單株免疫球蛋白血癥，反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥（monoelonal grammapathy of undetermined significance，MGUS）、重鏈病等的鑒別診斷。本文中3例骨髓細(xì)胞學(xué)找到典型的骨髓瘤細(xì)胞，但臨床檢查中免疫球蛋白及輕鏈檢測(cè)均是陰性，胞漿中輕鏈的檢測(cè)均陽性，給臨床確診和治療帶來了極大的便利。

本實(shí)驗(yàn)利用BD公司最新的熒光免疫表型抗體及破膜劑進(jìn)行胞膜抗原標(biāo)記及胞漿內(nèi)染色，其陽性率令人滿意，所有的45例患者均檢測(cè)到相對(duì)應(yīng)的胞漿輕鏈，而且與輕鏈檢測(cè)相對(duì)應(yīng)（除不分泌型外）。為臨床的診斷提供了極大的幫助。

總之，利用四色流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行CD45／SSC、CD38／CD56來標(biāo)記骨髓瘤細(xì)胞，并進(jìn)行 CD19、CD138、胞漿內(nèi)輕鏈的檢測(cè)，可準(zhǔn)確地識(shí)別骨髓瘤細(xì)胞，有助于MM的診斷及治療療效的監(jiān)測(cè)。

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