趙巍松，劉 伶，楊 飛

（馬鞍山市市立醫(yī)療集團(tuán) 臨床檢驗(yàn)中心，安徽 馬鞍山243000）

人類(lèi)巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）是一種雙鏈DNA病毒，屬于人類(lèi)皰疹病毒，HCMV在自然人群中感染非常普遍，發(fā)達(dá)國(guó)家的感染率為30－70%，我國(guó)人群的感染率在80%以上［2］，一般表現(xiàn)為無(wú)癥狀的潛伏感染［3］。HCMV是引起先天性及圍生期感染的重要病原微生物之一，可通過(guò)胎盤(pán)、產(chǎn)道、母乳或血液直接傳播給嬰兒，導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)、早產(chǎn)和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及畸形等，嚴(yán)重影響胎兒的健康［4］，在免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善的嬰兒及免疫缺陷者中可發(fā)生嚴(yán)重感染并可致死亡。該病毒可持續(xù)數(shù)年之久，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重危害。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在歐美新生兒HCMV先天感染率為0.2－2.2%，其中出生時(shí)即有癥狀者占10－15%，無(wú)癥狀的嬰兒中有10－15%遺留后遺癥，如智力遲緩、耳聾和視力損害。由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，實(shí)驗(yàn)室建立快速、靈敏且特異的檢測(cè)技術(shù)對(duì)兒童HCMV感染的早期診斷與治療至關(guān)重要［5］。近年來(lái)發(fā)展起來(lái)并應(yīng)用的各種檢測(cè)方法因有其各自的缺陷，尚不能完全滿(mǎn)足臨床早期、快速診斷的需要。本研究采用的熒光定量PCR（FQ－PCR）技術(shù)，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)領(lǐng)域中新一代檢測(cè)技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、快速、敏感度高等特點(diǎn)，是目前診斷HCMV感染的最敏感方法。我們通過(guò)對(duì)HCMV感染疑似患兒尿液、外周血白細(xì)胞以及與其配對(duì)的母乳進(jìn)行巨細(xì)胞病毒核酸檢測(cè)，以研究母乳的傳染性和母嬰傳播率。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

106例來(lái)自2009年2月至2010年12月在我院收治的通過(guò)母乳喂養(yǎng)的疑似HCMV感染患兒和母親乳汁標(biāo)本，年齡范圍在1天－12月嬰兒，納入標(biāo)準(zhǔn)參考1999年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)制定的CMV感染診斷方案［6］。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集 采集疑似患兒靜脈血，同時(shí)留取患兒新鮮尿液3ml于無(wú)菌的干燥管中。母乳采集用自我擠壓法（不用吸奶器），在清潔乳頭分?jǐn)?shù)次擠出3－5ml乳汁入無(wú)菌管中，立即送檢。

1.2.2 標(biāo)本處理 乳汁標(biāo)本：充分混勻乳汁，然后吸取1.0ml置無(wú)菌離心管，12 000rpm／min，離心5 min棄上清及脂層，取沉淀。尿液標(biāo)本：取1ml置于無(wú)菌管中，12 000rpm／min離心10min，棄上清，取沉淀。血液標(biāo)本：EDTA抗凝血1ml，加淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞。處理后的3種標(biāo)本用試劑盒提取DNA模板，加入已配好反應(yīng)體系的反應(yīng)管。

1.2.3 試劑與儀器 HCMV核酸擴(kuò)增（PCR）熒光定量檢測(cè)試劑盒由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供，引物序列為F5′－GCTAACTATGCAGAGCATGTA－3′，R5′－GCTGAGTTCTTGGTAAAGAAC－3′。儀器采用美國(guó)Perkin Elmer公司7300全自動(dòng)PCR分析儀。

1.2.4 擴(kuò)增條件 93℃2min預(yù)變性，然后按93℃45s→55℃60s，先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃30s→55℃45s，做30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后電腦自動(dòng)分析結(jié)果［7］。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）陰性結(jié)果判定：增長(zhǎng)曲線不是典型的S曲線。（2）陽(yáng)性結(jié)果判定：如果增長(zhǎng)曲線呈典型的S曲線且HCMV－D N A＞1×103拷貝／ml。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疑似HMCV感染患兒血、尿檢測(cè)結(jié)果比較

對(duì)106份血標(biāo)本和尿標(biāo)本進(jìn)行了FQ－PCR檢測(cè)，其中，血液檢測(cè)中HCMV－DNA陽(yáng)性的有47例占44.34%，尿液FQ－PCR檢測(cè) HCMV－DNA 陽(yáng)性61例占57.55%，兩種方法同時(shí)陽(yáng)性的有35例占12.26%。兩種檢測(cè)方法比較，P＜0.05，兩種方法具有顯著差異。尿檢陽(yáng)性率高于血檢。

2.2 106份母乳與配對(duì)患兒檢測(cè)結(jié)果比較

母乳檢測(cè)中HCMV－DNA陽(yáng)性的有68例，陰性38例，陽(yáng)性率為64.15%。其中，在患兒尿液HCMV－DNA陽(yáng)性的61例中，配對(duì)的母乳陽(yáng)性共54例，占88.5%（54／61），患兒尿液 HCMV－DNA陰性的45例中，配對(duì)母乳陽(yáng)性共14例，占31.1%（14／45），兩者比較，P＜0.05，差異有顯著意義。在患兒血液HCMV－DNA陽(yáng)性的47例中，配對(duì)的母乳陽(yáng)性共36例，占76.6%（36／47），患兒血液 HCMV－DNA陰性的59例中，配對(duì)的母乳陽(yáng)性共32例，占54.2%（32／59），兩者比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1和表2。

表1 尿檢患兒及配對(duì)的母乳HCMV－NDA檢測(cè)結(jié)果

表2 血檢患兒及配對(duì)的母乳HCMV－NDA檢測(cè)結(jié)果

3 討論

HCMV在自然人群中感染普遍，多表現(xiàn)為亞臨床不顯性感染和潛伏感染?？砷L(zhǎng)期間歇地從唾液、尿液、乳汁中排出，通過(guò)多途徑傳播。當(dāng)免疫功能低下時(shí)，病毒感染激活而發(fā)生顯性感染［8］。而孕期和兒童HCMV感染較為嚴(yán)重，感染后幾乎能侵犯機(jī)體的所有器官，是引起出生缺陷和各種不可逆損傷的一個(gè)重要因素，是導(dǎo)致小兒先天畸形、智力低下、發(fā)育遲緩，造成多系統(tǒng)多臟器病變的重要病原［9］。由于小兒感染病毒后臨床表現(xiàn)多為非特異性，若不及時(shí)診斷和治療，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的后遺癥。因此建立早期、快速、靈敏、特異、可靠的檢測(cè)和診斷方法顯得格外重要。FQ－PCR技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，融匯了PCR高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量的優(yōu)點(diǎn)，是目前準(zhǔn)確和快速的微生物定量方法，能早期、靈敏檢測(cè)到HCMV－DNA，且可進(jìn)行抗病毒治療效果監(jiān)測(cè)［10］。本實(shí)驗(yàn)采用FQ－PCR檢測(cè)技術(shù)將血液和尿沉淀HCMV－DNA結(jié)果的比較顯示，F(xiàn)Q－PCR檢測(cè)尿液的陽(yáng)性率為57.55%，血液陽(yáng)性率為44.34%，兩者比較（P＜0.05）差異有顯著性，可見(jiàn)尿標(biāo)本FQPCR檢測(cè)HCMV的敏感性要高于血標(biāo)本。是由于在急性感染期，腎臟的上皮細(xì)胞為病毒最易侵襲的場(chǎng)所，尤其是嬰幼兒的腎臟上皮細(xì)胞是較敏感的組織；血標(biāo)本HCMV－DNA測(cè)定陽(yáng)性，而尿標(biāo)本HCMV－DNA測(cè)定陰性，則可能與HCMV尿液間歇性排毒有關(guān)［11］。當(dāng)HCMV進(jìn)入宿主以后，通過(guò)血液傳播到全身各器官，并從各感染部位排出病毒，如在尿液中檢測(cè)到高濃度的HCMV則提示患者體內(nèi)HCMV處于活躍期并大量復(fù)制。尿液標(biāo)本取材方便，無(wú)創(chuàng)，易為家長(zhǎng)和小兒接受，所以采用FQ－PCR方法對(duì)小兒尿標(biāo)本檢測(cè)能起到快速、簡(jiǎn)潔、靈敏的作用，對(duì)提高HCMV感染的診斷率有實(shí)際的臨床意義。

有學(xué)者調(diào)查顯示，育齡婦女血清抗CMV－IgG陽(yáng)性率為71.65%，提示我國(guó)育齡婦女大多數(shù)感染過(guò)HCMV［12］。大多數(shù)孕婦感染后處于潛伏性感染狀態(tài)，妊娠期由于體內(nèi)激素變化引起病毒激活，而孕婦的血液、子宮頸分泌物是重要的傳染源，導(dǎo)致HCMV可能通過(guò)胎盤(pán)、產(chǎn)道引起母嬰傳播。作為產(chǎn)后感染HCMV的來(lái)源，母乳喂養(yǎng)一直未受到廣泛重視。本研究對(duì)通過(guò)母乳喂養(yǎng)的HCMV感染患兒或疑似感染患兒的母親乳汁進(jìn)行檢測(cè)，顯示乳汁HCMV－DNA的陽(yáng)性率達(dá)64.15%與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相近［13］，其中，在患兒尿液 HCMV－DNA陽(yáng)性且配對(duì)母乳陽(yáng)性的占88.5%（54／61），尿液 HCMV－DNA陰性而配對(duì)母乳陽(yáng)性的占31.1%（14／45）；在患兒血液HCMV－DNA陽(yáng)性中，配對(duì)的母乳陽(yáng)性占76.6%（36／47），患兒血液 HCMV－DNA 陰性中，配對(duì)的母乳陽(yáng)性占54.2%（32／59），將其兩兩進(jìn)行比較，具有顯著差異（P＜0.05），故推測(cè) HCMV感染母乳可能是嬰兒感染HCMV的主要途徑之一。

綜上所述，母乳是嬰兒最理想的食物，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是其他配方乳品所無(wú)法替代的，因此如何快速檢測(cè)母乳是否感染HCMV，以及嬰幼兒的早期診斷有著十分重要的意義。FQ－PCR的推廣應(yīng)用，對(duì)提高我國(guó)人口素質(zhì)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育有著深遠(yuǎn)意義。

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