王志新，王明鶴，高曉群＊

（1.鄭州大學基礎醫(yī)學院 人體解剖學教研室 河南 鄭州 450052，2.鄭州市衛(wèi)校 人體解剖學教研室 河南 鄭州 450052）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)損傷中最常見的疾?。?］，損傷后引起的神經(jīng)源性膀胱功能障礙一直是未能很好解決的臨床難題之一，探索解決這一問題的途徑，有利于提高截癱患者的生活質量，降低其死亡率。神經(jīng)源性膀胱理想的治療手段是實現(xiàn)膀胱的可控性排尿［2］，而尿道外括約肌是實現(xiàn)膀胱可控性排尿的物質基礎。尿道外括約肌是環(huán)繞尿道膜部的橫紋肌，受陰部神經(jīng)支配。在正常雄性大鼠其低級中樞位于脊髓L6～S1節(jié)段的骶副交感核，陰部神經(jīng)興奮時可使外括約肌收縮；而尿道外括約肌的松弛，則是陰部神經(jīng)活動的反射性抑制所造成的。我們運用氯化金壓片染色技術從形態(tài)學方面研究L6前根切斷再吻合后大鼠尿道外括約肌運動終板的恢復情況，為臨床治療神經(jīng)源性膀胱提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

SPF級成年雄性大鼠77只（鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心提供），體質量180～200g，隨機分為正常組、假手術組、手術組3組。

1.2 實驗動物的處理

正常組大鼠不作任何處理。手術組用體積分數(shù)為10% 水合氯醛（300 mg／kg）腹腔注射麻醉，剃去背部體毛，俯臥位，消毒后取背部正中切口，依次切開皮膚、淺筋膜，向兩側鈍性分離豎脊肌，牽開肌肉和皮膚，辨認L6～S1間隙的位置；用咬骨鉗咬開L4～L6棘突和左側椎板，打開硬脊膜，手術顯微鏡下用神經(jīng)剝離子及神經(jīng)拉鉤仔細分離出左側L6 前根，在L6神經(jīng)出椎間孔水平分別離斷其前根，用10－0無損傷針線椎管內吻合L6前根中樞端和外周端，同時把右側的L6 截斷不縫合，關閉椎管，間斷縫合皮膚。術后每日肌注氨芐西林，連續(xù)15d，用外力擠壓排空膀胱，3～4次／d。假手術組同手術組把兩側L6分別截斷但不縫合。

1.3 氯化金壓片染色法［3］

收集術后1、4、8、16周的3組大鼠，體積分數(shù)為10%的水合氯醛麻醉，取尿道外括約肌立即放入冰箱冷凍，24h后進行氯化金壓片染色法：①固定：將尿道外括約肌沿肌纖維走向平均分為三部分，放入體積分數(shù)為15% 檸檬酸浸泡1～1.5h，避光存放，直到肌肉透明為止，用蒸餾水洗一遍，然后移至濾紙上吸去多余的檸檬酸。②鍍金：將透明的尿道外括約肌移入體積分數(shù)為1%氯化金水溶液1.5～2.0h浸染成金黃色，取出后用濾紙吸去多余的氯化金，應嚴格避光。③還原：將金黃色的尿道外括約肌移入體積分數(shù)為20% 甲酸24～26h，避光保存。④尿道外括約肌從甲酸取出，用蒸餾水洗5～6次（10min／次）后放入純甘油中過夜。⑤將尿道外括約肌從純甘油中取出放在濾紙上，用針狀物將肌肉分為3段，移置于載玻片上，滴純甘油，加蓋玻片順肌纖維方向將其輕輕壓平，注意防止神經(jīng)纖維和運動終板斷碎。在顯微鏡下觀察尿道外括約肌運動終板形態(tài)學變化。

2 結果

光鏡下觀察，正常組肌纖維排列有序，運動終板呈橢圓或卵圓形分布于肌纖維表面，結構完整，邊緣光滑；手術組、假手術組術后1周尿道外括約肌運動終板在著色、結構上與正常組無明顯差別；手術組、假手術組術后4周尿道外括約肌運動終板開始出現(xiàn)退變，終板染色變淺，軸索終末分枝減少，部分終板邊緣皺縮，中央出現(xiàn)空泡樣淡染區(qū)；手術組、假手術組術后8周尿道外括約肌運動終板明顯退變，出現(xiàn)大的染色空白區(qū)，終板減少甚至消失，顯示模糊的輪廓；術后16周，假手術組尿道外括約肌運動終板消失，僅有少量的神經(jīng)絲，而手術組尿道外括約肌運動終板增多，在著色和結構上接近正常組。見圖1。

1 各組不同時間尿道外括約肌運動終板的形態(tài)學變化

3 討論

當膀胱內尿量充盈到一定程度時（400～500mL），膀胱壁的牽張感受器受到刺激而興奮，沖動沿盆神經(jīng)傳入，到達骶髓的排尿反射初級中樞；同時，沖動也到達腦干和大腦皮層的排尿反射高位中樞，并產(chǎn)生排尿欲。排尿反射進行時，沖動沿盆神經(jīng)傳出，引起逼尿肌收縮、尿道內括約肌松弛，于是尿液進入后尿道，這時尿液刺激尿道的感受器，沖動沿陰部神經(jīng)再次傳到脊髓排尿中樞，進一步加強其活動，使尿道外括約肌開放，于是尿液被強大的膀胱內壓（可高達14.7kPa）驅出［4］，只有尿道外括約肌功能正常時，才能實現(xiàn)可控性排尿。在正常生理狀態(tài)下，運動神經(jīng)元通過運動終板與骨骼肌纖維建立聯(lián)系，支配骨骼肌完成各種生理功能［5］。神經(jīng)損傷后，遠端軸突發(fā)生Waller變性，導致運動終板超微結構改變明顯，神經(jīng)再生時，運動終板超微結構恢復正常［6］。大鼠L6前根切斷吻合術后，如果再生的神經(jīng)纖維能到達尿道外括約肌并形成運動終板，那么我們可以看到尿道外括約肌上運動終板的形態(tài)、數(shù)量的變化從而判斷運動終板的再生或恢復情況。

從實驗結果可知，L6前根切斷吻合術后到16周時，手術組大鼠尿道外括約肌運動終板不論是形態(tài)還是數(shù)量都接近正常組大鼠，而假手術組到16周時尿道外括約肌運動終板則完全退化，僅有少量的神經(jīng)絲。由此我們推測，手術組中觀察到的運動終板，可能是再生的神經(jīng)纖維沿原內臟神經(jīng)既往路徑到達靶器官——尿道外括約肌，并與之形成的新的運動終板。

總之，L6前根切斷再吻合后，大鼠尿道外括約肌運動終板在術后16周前逐漸減少，16周后運動終板逐漸增多。但再生的運動終板功能是否正常以及這種現(xiàn)象與吻合神經(jīng)再生修復的相關性仍需進一步的實驗研究。

［1］吳萍，鄧娟，鄧錦波.脊髓的發(fā)育與脊髓畸變及脊髓損傷［J］.河南大學學報：醫(yī)學版，2012，31（2）：134－137.

［2］Vastenholt J M，Snoek G J，Buschman H P，et al.A 7－year follow－up of sacral anterior root stimulation for bladder control in patients with a spinal cord injury：quality of life and users＇experiences［J］.Spinal Cord，2003，41（7）：397－402.

［3］張賽霞，羅灼玲.氯化金壓片顯示運動終板方法的探索［J］.解剖學研究，2000，22（2）：153－154.

［4］Groat W C，Wickens C.Organization of the neural switching circuitry underlying reflex micturition［J］.Acta Physiol（Oxf），2013，207（1）：66－84.

［5］Batchelor P E，Wills T E，Hewa A P，et al.Stimulation of axonal sprouting by trophic factors immobilized within the wound core［J］.Brain Res，2008，53（1209）：49－56.

［6］Yampolsky P，Pacifici P G，Witzemann V.Differential muscle－driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation［J］.Eur J Neurosci，2010，31（4）：646－658.