石貞玉，厲永強

（1.河南大學(xué) 神經(jīng)生物學(xué)研究所，河南 開封 475004；2.河南大學(xué) 護理學(xué)院，河南 開封 475004）

環(huán)維黃楊星D（Cyclovirobuxine D，CVB－D）系從黃楊科植物小葉黃楊（Buxus microphylla Sieb.et Zucc.Var.Sinica Rehd.et Wils）及其同屬植物中提取的一種生物堿，稱黃楊寧，亦稱環(huán)常綠黃楊堿D、黃楊堿等，屬孕甾烷衍生物［1］。目前認為環(huán)維黃楊星D通過抑制脂質(zhì)過氧化、清除自由基等對神經(jīng)元具有保護作用。已有研究［2］發(fā)現(xiàn)，環(huán)維黃楊星D 對急性缺血、缺氧時的損害性病變有改善和保護作用，同時，環(huán)維黃楊星D 有促進腦缺血損傷區(qū)神經(jīng)功能的修復(fù)作用，對神經(jīng)元具有保護作用。

PC12細胞是鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的細胞株，分化的PC12細胞在形態(tài)和功能上具有典型的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的特征［3］。兒茶酚胺類物質(zhì)在生物體內(nèi)具有較強的生理學(xué)效應(yīng)，在腦和神經(jīng)信號傳導(dǎo)中起著重要的作用，同時這類物質(zhì)具有抗氧化、抗誘變和抗衰老等作用［4－5］。為此，我們的課題通過對環(huán)維黃楊星D 進行結(jié)構(gòu)改造，以協(xié)同或增效為目的引入具有神經(jīng)保護作用的兒茶酚胺類基團，合成環(huán)維黃楊星D 兒茶酚新衍生物（HD－X）。實驗采用酒精誘導(dǎo)PC12細胞損傷模型初步發(fā)現(xiàn)，HD－X 對酒精誘導(dǎo)的PC12細胞損傷有較好的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞PC12（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所），生長在含100mL／L胎牛血清（四季青公司產(chǎn)品）的DMEM 培養(yǎng)基（Gibco公司產(chǎn)品）中，放置在含體積分數(shù)為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；HD－X 由河南大學(xué)藥物研究所提供，純度＞99%；二甲基亞砜（DMSO，Solarbi公司生產(chǎn)），貯存濃度為1×10－2mol／L；四甲基偶氮唑藍（MTT）（Promega公司）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（上?？婆d生物科技有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞PC12培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10% 滅活胎牛血清、青霉素（100IU／mL）和鏈霉素（100 mg／L）的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)體系中。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，含體積分數(shù)為5%CO2。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，實驗共分4組：①正常對照組：不加任何處理。②酒精損傷組：2×10－1moL／L 酒精。③酒精損傷＋HD－X 1 組：1×10－5moL／L的HD－X預(yù)處理30min，再 加2×10－1moL／L酒精。④酒精損傷＋HD－X2組：1×10－4moL／L的 HD－X預(yù)處理30 min，再加2×10－1moL／L酒精。繼續(xù)培養(yǎng)24h。

1.2.2 MTT 試驗 細胞以1×104／L接種到96孔細胞培養(yǎng)板，0.2mL／孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后換液，分組與處理方法同“1.2.1”。MTT 實驗按照文獻［5］的方法進行。

1.2.3 Hoechst 33258 染色法觀察細胞凋亡形態(tài)變化對數(shù)生長期細胞按1×104個／mL 濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上，制作細胞玻片。分組與處理方法同“1.2.1”，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，傾去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS洗滌細胞2次；調(diào)整Hoechst 33258染液濃度至終濃度5 mg／L，37℃避光染色10min；棄去染液，加入體積分數(shù)為4% 多聚甲醛4℃固定5min。在熒光顯微鏡下觀察拍攝。激發(fā)波長在350nm 左右，發(fā)射波長在460nm 左右。

1.2.4 LDH 活性測定 酒精損傷發(fā)生后24h收集培養(yǎng)液，用722型分光光度計在340nm 波長下測定LDH的活性。LDH 釋放抑制率＝（LDH酒精組－LDHHD－X）／（LDH酒精組－LDH對照組）×100%。

2 結(jié)果

2.1 對細胞存活率的影響

在有HD－X 保護的實驗組中，PC12細胞對MTT的攝取能力高于模型組（P＜0.05 或P＜0.01），細胞存活率升高，表明HD－X 對酒精誘導(dǎo)的PC12細胞損傷模型具有保護作用。見表1。

表1 HD－X對酒精誘導(dǎo)PC12細胞損傷存活率的影響（）

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

酒精作用PC12細胞組中，Hoechst 33258 染色觀察細胞凋亡形態(tài)學(xué)變化，表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集，細胞核碎裂成碎片等典型細胞凋亡特征性變化，在有HD－X保護的實驗組中，可見凋亡細胞的數(shù)量明顯下降。見圖1。

2.3 對LDH 釋放的影響

PC12細胞在酒精損傷后釋放至培養(yǎng)液中的LDH 增多，與正常對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而加入含HD－X的2個劑量組中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中LDH 含量的降低（P＜0.05或P＜0.01），漏出減少，表示HD－X 對酒精誘導(dǎo)的PC12細胞損傷具有一定的保護作用。見表2。

圖3 HD－X對酒精誘導(dǎo)PC12細胞損傷的保護作用形態(tài)學(xué)觀察

表2 HD－X對酒精誘導(dǎo)PC12細胞損傷后細胞LDH 釋放的影響（）

3 討論

研究［6－8］表明，酒精可能通過增加自由基的產(chǎn)生，影響神經(jīng)遞質(zhì)受體的功能，誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，干擾神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路，激活內(nèi)源性的細胞凋亡信號途徑等分子機制，促進神經(jīng)細胞的損傷，與阿爾茨海默氏病及其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病有密切聯(lián)系。PC12細胞為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株，與原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞模型相比，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的一般特征，是國際上基本公認在體外進行神經(jīng)生物、神經(jīng)化學(xué)及神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究理想的模型，用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如阿爾茨海默病，帕金森病等，廣泛用作研究神經(jīng)細胞分化、離子通道、受體和遞質(zhì)釋放的實驗材料，也是研究神經(jīng)毒性的最主要的細胞株之一［9］。

實驗結(jié)果表明，酒精對PC12細胞具有明顯的抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。而預(yù)先給予HD－X 后，酒精對PC12 細胞的增殖抑制作用減輕，細胞凋亡率下降。LDH 是細胞質(zhì)膜標記酶，反映細胞死亡常用的生化指標。培養(yǎng)液中LDH 漏出率在酒精組中明顯高于對照組，而預(yù)先給予HD－X 后，細胞上清液中的LDH 含量明顯減少，提示HD－X 可減輕酒精所致的神經(jīng)元損傷，對神經(jīng)元具有一定的保護作用。

綜上所述，HD－X 對酒精誘導(dǎo)PC12細胞損傷具有顯著的保護作用，關(guān)于其保護作用的分子機制還需要今后不斷的深入研究和探討。

［1］瞿凌晨，邢精紅，許立，等.環(huán)維黃楊星D 對大鼠心肌缺血－再灌注損傷的保護作用初探［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，14（1）：67－68.

［2］譚峰，顧衛(wèi)，萬賽英，等.環(huán)維黃楊星D 對高血壓大鼠腦缺血神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白與神經(jīng)粘蛋白表達的影響［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6（4）：349－353.

［3］Westerink R H，Ewing A G.The PC12cell as model for neurosecretion［J］.Acta Physiol（Oxf），2008，192（2）：273－285.

［4］Garcia C R，Angele－Martinez C，Wilkes J A，et al.Prevention of iron－and copper－mediated DNA damage by catecholamine and amino acid neurotransmitters，L－DOPA，and curcumin：metal binding as a general antioxidant mechanism［J］.Dalton Trans，2012，41（21）：6458－6467.

［5］Shimizu T，Nakanishi Y，Nakahara M，et al.Structure Effect on Antioxidant Activity of Catecholamines toward Singlet Oxygen and Other Reactive Oxygen Species in vitro［J］.J Clin Biochem Nutr，2010，47（3）：181－190.

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［7］Rump T J，Abdul M P M，Szlachetka A M，et al.Acetyl－L－carnitine protects neuronal function from alcohol－induced oxidative damage in the brain［J］.Free Radic Biol Med，2010，49（10）：1494－1504.

［8］胡艷秋，蔣杞英，程相樹，等.乙醇對發(fā)育期小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量的影響［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，26（3）：20－22.

［9］Greene L A，Tischler A S.Establishment of a noradrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1976，73（7）：2424－2428.