王淑蘭,倪光夏,2

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針刺督脈經(jīng)穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶MAP-2、NF-L的mRNA表達(dá)的影響

王淑蘭1,倪光夏1,2

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210029;2.江蘇省第二中醫(yī)院,南京 210017)

觀察針刺督脈經(jīng)穴對腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)微管相關(guān)蛋白MAP-2和神經(jīng)微絲蛋白NF-L的mRNA表達(dá)的影響,并探討其可能的作用機制。以針刺督脈經(jīng)穴為干預(yù)手段,以大鼠急性局灶性腦缺血再灌注模型作為研究對象,運用SYBR Green實時定量PCR觀測腦缺血再灌注后缺血半暗帶MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)變化,并觀察針刺對上述指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用規(guī)律。針刺組和對照組MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)較模型組均顯著升高(＜0.01),且針刺組升高更顯著(＜0.05)。針刺督脈經(jīng)穴能上調(diào)MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)元樹突和軸突的出芽和再生,提高神經(jīng)元的可塑性,可能是針刺督脈經(jīng)穴發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制之一。

針刺;電針;腦缺血再灌注;大鼠;PCR

腦梗死(Cerebral Infarction)是由于腦部血流供應(yīng)障礙,缺血、缺氧引起的局灶性腦組織的缺血性壞死或軟化。其發(fā)病率、病死率、致殘率和復(fù)發(fā)率均較高,不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,而且為社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān),探尋有效的治療方法一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究方向。本實驗應(yīng)用線栓法制備大鼠局灶性腦缺血與再灌注模型,通過針刺督脈經(jīng)穴,觀察神經(jīng)細(xì)胞微管相關(guān)蛋白MAP-2和神經(jīng)微絲蛋白NF-L 的mRNA表達(dá)變化,進(jìn)一步探討針刺保護(hù)腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的作用機制。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

清潔級雄性SD大鼠40只,體重(150±10)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限責(zé)任公司[動物許可證號:SCXK(滬)2008-0016],飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。按隨機數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、缺血再灌注模型組(模型組)、針刺督脈經(jīng)穴組(針刺組)、針刺陽明經(jīng)穴組(對照組),共5組,每組8只。

1.2 主要儀器及試劑

韓氏LH402A穴位神經(jīng)電刺激儀,核酸蛋白測定儀(Eppendorf公司),基因擴增儀MJ-mini(BIO-RAD公司),實時定量PCR儀Mx3000P(Stratagene公司),總RNA提取試劑RNAiso Plus(Takara公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Master Mix(Takara公司),SYBR Premix Ex Taq(Takara公司)。

1.3 模型制備

參照Longa[1]線栓法并加以改進(jìn)。SD大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g體重i.p)麻醉,仰臥固定。常規(guī)消毒后,于頸部正中切開,鈍性分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA)。結(jié)扎ECA遠(yuǎn)心端,用微型動脈夾夾住CCA近心端及ICA,在靠近CCA分叉處用眼科剪在ECA上剪一小口,將直徑0.235 mm的尼龍釣絲用火烤成小球的一端沿小切口插入ECA,剪斷ECA遠(yuǎn)心端,將ECA反向拉直,使其與ICA處于同一直線上,移去ICA的動脈夾,經(jīng)CCA分叉處將釣絲緩慢向ICA入顱腦內(nèi)的方向推進(jìn)約17～18 mm,微遇阻力時停止,使釣絲頭端到達(dá)較細(xì)的大腦中動脈起始處?？`緊預(yù)先放置于穿刺小切口處的絲線,縫合,消毒,于缺血2 h后拔出栓線,建立缺血再灌注模型。假手術(shù)組大鼠只分離暴露CCA、ECA、ICA,結(jié)扎ECA。正常組不進(jìn)行手術(shù)處理。

參考Bederson6級5分法。正常為5級(0分);對側(cè)上肢不能完全伸展為4級(1分);向?qū)?cè)推時抵抗力下降為3級(2分);提尾時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2級(3分);自動轉(zhuǎn)圈為1級(4分);無自發(fā)性活動、意識障礙為0級(5分)。對再灌注后大鼠即刻進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分,達(dá)到1～4分視為造模成功。之后觀測缺血再灌注24 h后各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分以明確其變化。

1.4 治療方法

取穴根據(jù)中國針灸學(xué)會實驗針灸研究會制定的“動物針灸穴位圖譜”選取相應(yīng)穴位。針刺組取穴以督脈經(jīng)穴為主,取水溝、百會、風(fēng)府、大椎。在動物模型制備成功1 h時進(jìn)行1次針刺。選用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.30 mm×13 mm針灸針進(jìn)行治療。水溝直刺深度為0.2寸;百會向后呈15°平刺,采用快速捻轉(zhuǎn)的手法2 min;風(fēng)府、大椎穴直刺0.2～0.3寸,1 min/穴/次,行平補平瀉。此外,分別對水溝、百會,風(fēng)府、大椎通韓氏LH402A穴位神經(jīng)電刺激儀,頻率為2 Hz,強度為2 mA。

1.5 標(biāo)本處理

確認(rèn)各組模型已建立。于造模后24 h斷頭處死動物,快速取腦,取病變側(cè),將缺血中心壞死區(qū)、嗅球及小腦去掉,取缺血壞死區(qū)周圍的缺血半暗帶,迅速放入液氮中冷凍,稍后置于﹣80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 腦組織MAP-2、NF-L的mRNA表達(dá)檢測

運用SYBR Green實時定量PCR檢測方法檢測腦組織中MAP-2、NF-L的mRNA表達(dá)。

1.6.1 總RNA制備

腦組織100～200 mg,分別加入1 mL RNAiso Plus,按試劑說明書中操作步驟進(jìn)行RNA提取。使用Eppendorf公司的核酸蛋白測定儀檢測抽提總RNA的質(zhì)量和濃度。要求A260/A280比值約2.0,并計算RNA含量。

1.6.2 cDNA合成

反應(yīng)體系30mL。取5×PrimeScript Buffer(含有PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、反應(yīng)Buffer)6mL,每一標(biāo)本取總RNA 1.5mg,加RNase Free dH2O至30mL。37℃ 15 min,85℃ 5 s進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

1.6.3 引物

MAP-2和NF-L基因使用引物設(shè)計軟件primer5.0,分別參照GeneBank序列號NM_013066.1和NM_031783.1跨內(nèi)含子設(shè)計,大連Takara合成。MAP-2上游引物為CAGAACAAACAGCTGCACTGGA(方向為5’to 3’);下游引物為TCTAAAGGCTCAGCGAATGAGGA(5’to 3’)。NF-L上游引物為CCATCAGCAACGACCTCAAGTCTA (5’to 3’);下游引物為CGGCTTCCAGGACCTTGTTC(5’to 3’)。b-actin作為內(nèi)參。

1.6.4 SYBR Green實時定量PCR

25mL的反應(yīng)體系中包括:SYBR Premix Ex Taq(內(nèi)含Takara Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2﹢,Tli RNaseH,SYBR GreenⅠ等) 12.5mL;上下游引物各5mL(1mmol);ROX Reference DyeⅡ(用于校正孔與孔之間的熒光信號誤差)0.5mL; cDNA標(biāo)本2mL。反應(yīng)體系加入實時定量PCR儀Mx3000P (Stratagene公司)進(jìn)行PCR擴增。兩步法PCR擴增,預(yù)變性反應(yīng)條件為95℃ 30 s,1Cycle;PCR反應(yīng)為95℃ 5 s,60℃ 20 s,40 Cycle。將檢測的臨界點設(shè)定在PCR擴增過程中,熒光信號由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)(threshold cycle,Ct)值處。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析,組間比較方差齊時選擇LSD法。同組間治療前后比較采用配對檢驗,差值d不服從正態(tài)分布時選擇非參數(shù)檢驗。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評分比較

由表1可見,模型組、針刺組、對照組大鼠神經(jīng)功能評分與正常組和假手術(shù)組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。針刺組、對照組治療前大鼠神經(jīng)功能評分與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。針刺組、對照組治療后大鼠神經(jīng)功能評分與模型組比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.01)。針刺組、對照組治療后大鼠神經(jīng)功能評分與同組治療前比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。針刺組治療后大鼠神經(jīng)功能評分與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 (±s,分)

注:與正常組、假手術(shù)組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.01;與對照組比較3)＜0.05;同組內(nèi)治療前比較4)＜0.05

2.2 各組MAP-2、NF-L的mRNA水平比較

采用b-actin作為內(nèi)參,利用樣本MAP-2、NF-L與b-actin的mRNA含量的比值,作為評價MAP-2和NF-L的mRNA相對表達(dá)水平的指標(biāo)。以2﹣△△Ct法表示相對定量結(jié)果。根據(jù)公式△Ct=[Ct(MAP-2或NF-L)]－[Ct(b-actin)]、△△Ct=[△Ct(實驗組))－[△Ct(正常組)],2﹣△△Ct表示實驗組MAP-2或NF-L相對于正常組原始拷貝數(shù)的倍數(shù)差異,即表示MAP-2或NF-L在兩組表達(dá)的相對變化。

表2 各組MAP-2、NF-L的mRNA水平比較 (±s)

注:與正常組比較1)＜0.01;與模型組比較2)＜0.01;與對照組比較3)＜0.05

由表2可見,正常組大鼠腦組織中有少量MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)。假手術(shù)組MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)與正常組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)。模型組MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)較正常組明顯下降(＜0.01)。與模型組比較,針刺組和對照組MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)均上調(diào)(＜0.01),且與對照組比較,針刺組上調(diào)更為顯著(＜0.05)。

3 討論

神經(jīng)元對缺血敏感,腦梗死發(fā)生后,梗死區(qū)的神經(jīng)元即發(fā)生不可逆性損傷,而缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)元則處于可逆狀態(tài)。挽救這些殘存腦組織,恢復(fù)神經(jīng)運動功能是當(dāng)務(wù)之急。而神經(jīng)系統(tǒng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能的可塑性是恢復(fù)神經(jīng)運動功能的基礎(chǔ)。神經(jīng)元樹突及軸突的出芽和再生是神經(jīng)元在損傷及缺血時發(fā)生可塑性變化的重要標(biāo)志[2]。

MAP-2和NF均為神經(jīng)細(xì)胞骨架的成分,分別存在于神經(jīng)細(xì)胞的樹突和軸突以及胞體中,兩者對于神經(jīng)元的發(fā)育、分化、重塑、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維持、神經(jīng)元突起的生長等具有重要意義[3]。NF分別由低相對分子質(zhì)量(NF-L)、中等相對分子質(zhì)量(NF-M)和高相對分子質(zhì)量(NF-H)3種亞單位組成,我們選取NF-L為觀測指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,針刺督脈經(jīng)穴能使局灶性腦缺血再灌注大鼠缺血半暗帶區(qū)MAP-2和NF-L的mRNA表達(dá)上調(diào),由此證實針刺督脈經(jīng)穴能促進(jìn)神經(jīng)元樹突和軸突的出芽和再生,提高神經(jīng)元的可塑性,從而改善神經(jīng)功能缺損狀態(tài),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

[1] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S,. Reversible middlecerebral artery occusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1): 84-91.

[2] Glauser T, Ben-Menachem E, Bourgeois B,. ILAE treatment guidelines: evidence-based analysis of antiepileptic drug efficacy and effectiveness as initial monotherapy for epileptic seizures and syndromes[J]. Epilepsia, 2006,47(7):1094-1120.

[3] LoPachin RM, He D, Reid ML. 2, 5-Hexanedione-induced changes in the neurofilament subunit pools of rat peripheral nerve[J]. Neuroto- xicology, 2005,26(2):229-240.

Effect of Acupuncture at Du Meridian Points on the Expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the Ischemic Penumbra in Rats with Focal Cerebral Ischemia and Reperfusion

-1,-1,2.

1.,210029,; 2.,210027,

To investigate the effect of acupuncture at Du meridian points on the expressions of neuronal microtubule- associated protein 2 (MAP-2) mRNA and neurofilament protein L (NF-L) mRNA in the ischemic penumbra in rats with cerebral ischemia and reperfusion and explore the possible mechanism of its action.Acupuncture at Du meridian points was used as an Interventional measure. A rat model of focal cerebral ischemia and reperfusion was used as a subject. The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs in the ischemic penumbra were examined using SYBR Green real-time and quantitative PCR after cerebral ischemia and reperfusion. Regularities in the adjusting effect of acupuncture on the above indices were observed.The expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs increased significantly in the acupuncture and control groups compared with the model group (＞0.01) and increased more in the acupuncture and control group (＜0.05).Acupuncture at Du meridian points can upregulate the expressions of MAP-2 and NF-L mRNAs, promote the germination and regeneration of neuronal dendrites and axons and improve neuronal plasticity. That may be one of the mechanisms by which acupuncture at Du meridian points produces a protective effect on the nerve.

Acupuncture; Electroacupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion; Rats; PCR

1005-0957(2013)03-0221-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.03.221

2012-10-13

王淑蘭(1986 - ),女,住院醫(yī)師

倪光夏(1964 - ),男,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,E-mail:gn66@ 163.com