鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450052

MACC1基因干擾對卵巢上皮性癌細(xì)胞增殖和順鉑耐藥的影響

鄧佑興 史惠蓉 李霞 張瑞濤

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450052

背景與目的：有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)在多種腫瘤中高表達(dá)，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2信號通路影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程。而對于MACC1在卵巢癌中的作用研究甚少。本研究應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)逆轉(zhuǎn)卵巢上皮性癌耐藥細(xì)胞中MACC1基因的表達(dá)，并探討MACC1基因表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系。方法：前期設(shè)計(jì)的針對MACC1 mRNA的小發(fā)卡狀RNA(shRNA)轉(zhuǎn)染卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP細(xì)胞，RT-PCR及Western blot檢測MACC1 mRNA和蛋白表達(dá)的變化；四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測轉(zhuǎn)染前后SKOV3/DDP細(xì)胞的增殖及對順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC50)，流式細(xì)胞儀測定順鉑處理前后各組細(xì)胞凋亡率。Western blot檢測ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的變化。實(shí)驗(yàn)分3組：空白組為未經(jīng)處理的SKOV3/DDP細(xì)胞，陰性對照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒p-super-EGFP-1，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA。結(jié)果：與其他兩組細(xì)胞相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞MACC1 mRNA及蛋白降低，對順鉑的IC50較低(26.094 vs 47.501/47.089 μmol/L，P＜0.05)，p-ERK1/2蛋白表達(dá)下降(0.3979 vs 0.6712/0.6681，P＜0.05)，順鉑處理前、后凋亡率增加(1.32% vs 0.66%/0.48%，P＜0.05；36.70% vs 18.53%/16.60%，P=0.000)。結(jié)論：MACC1基因表達(dá)下調(diào)能在一定程度上恢復(fù)SKOV3/DDP細(xì)胞對順鉑的敏感性，可能與ERK1/2通路有關(guān)。

結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1；卵巢癌；順鉑；細(xì)胞外信號激酶

已有研究［1-2］表明，結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)可作為細(xì)胞外信號激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2信號通路的上游調(diào)控因子，而卵巢癌的順鉑耐藥與ERK1/2信號通路密切相關(guān)。因此，推測MACC1基因可能參與卵巢癌順鉑耐藥的調(diào)控。本研究旨在通過RNAi技術(shù)沉默人卵巢癌耐藥細(xì)胞系SKOV3/ DDP細(xì)胞中MACC1表達(dá)，并觀察MACC1基因干擾前后卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)行為的變化，探討MACC1與卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 主要材料

人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫；真核熒光表達(dá)載體p-super-EGFP-1由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室張欽憲教授惠贈；重組質(zhì)粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA由本課題組前期構(gòu)建；RevertAid Frist Strand cDNA購自加拿大Formentas公司；DNA&siRNA InterferinTM轉(zhuǎn)染試劑購于美國Polyplus Transfection公司；MTT購自Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Hyclone公司；順鉑購自云南生物谷制藥公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自凱基公司；兔抗人MACC1抗體購自Abcam公司、兔抗人β-actin抗體及羊抗兔單克隆IgG購自CST公司，兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2抗體購自北京博奧森公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

SKOV3/DDP細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)、傳代。培養(yǎng)條件為37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，飽和濕度。分為3組：空白組為未經(jīng)處理的SKOV3/DDP細(xì)胞，陰性對照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒p-super-EGFP-1，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA。重組質(zhì)粒按北京康為世紀(jì)有限公司質(zhì)粒小量提取試劑盒說明進(jìn)行提取，并利用Nano Drop 2000軟件鑒定質(zhì)粒純度和濃度。采用DNA&siRNA InterferinTM轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，以含800 μg/mL G418的選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

檢測SKOV3/DDP細(xì)胞中MACC1 mRNA的表達(dá)：TRIzol分別提取3組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，以其為模板分別以MACC1、β-actin cDNA上、下游引物分管擴(kuò)增目的基因及內(nèi)參對照，MACC1上游引物序列：5’-CCTTCGTGGTAATA ATGCTTCC-3’，下游引物序列：5’-AGGGCTTCCATTGTATTGAG GT-3’，產(chǎn)物696 bp；β-actin上游引物序列：5’-GGCGGCACCACCATGTACCCT-3’，下游引物序列：5’-AGGGGCCGGAC TCGTCATACT -3’，產(chǎn)物220 bp。MACC1引物參照參考文獻(xiàn)［9］引物序列，由生工生物(上海)工程技術(shù)有限公司合成；β-actin引物購自寶生物工程(大連)有限公司。PCR反應(yīng)條件：94 ℃3 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，循環(huán)35次，最后，72 ℃ 5 min，4 ℃終止。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)中觀察和拍照，ImageJ軟件分析處理PCR圖像，以MACC1與β-actin灰度值的比值代表MACC1 mRNA的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot檢測MACC1、ERK1/2及p-ERK1/2 蛋白表達(dá)

分別提取3組細(xì)胞總蛋白，Bradford法行蛋白定量。蛋白變性后，10%SDS-PAGE電泳，45 V恒壓濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉TBST封閉2 h，加入一抗(兔抗人MACC1 1∶500，兔抗人ERK1/2 1∶100，兔抗人p-ERK1/21∶100，兔抗人β-actin 1∶1 000)，4 ℃過夜，加入二抗(羊抗兔1∶1 000)室溫1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。采用ImageJ軟件分析特異性蛋白條帶灰度值，β-actin設(shè)為內(nèi)參，以目標(biāo)蛋白與β-actin條帶灰度值的比值代表目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖

3組細(xì)胞以5×103/孔傳至96孔板，于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。每組設(shè)6復(fù)孔，結(jié)果取均值。分別培養(yǎng)24、48、72 h后加入5 mg/mL MTT 10 μL，繼續(xù)溫育4 h。棄上清液，加入二甲亞砜100 μL，搖床振蕩10 min，用Bio-Rad酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度(A)值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.5 MTT法檢測細(xì)胞對順鉑耐藥性

本實(shí)驗(yàn)所用順鉑終濃度為10、20、30、40、50、60 μmol/L，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。加藥培養(yǎng)48 h后測定A值。計(jì)算不同濃度順鉑對5組細(xì)胞的抑制率，細(xì)胞抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組A/空白組A。應(yīng)用Probit概率回歸法計(jì)算IC50值。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡

測定未加順鉑和順鉑用量均為未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的IC50時，各組細(xì)胞的凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)均以表示，多組比較采用方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多個樣本均數(shù)兩兩比較采用LDS法方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞MACC1 mRNA的表達(dá)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，空白組、陰性實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)組中MACC1 mRNA的表達(dá)水平分別是0.519 4±0.009 3、0.509 8±0.005 7、0.081 4±0.002 8，實(shí)驗(yàn)組明顯低于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8796.3，P＜0.05)；而陰性對照組和空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

圖 1 RT-PCR鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后3組細(xì)胞MACC1 mRNA表達(dá)效果Fig. 1 MACC1 mRNA expressions in each group by RT-PCR

2.2 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞MACC1、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組與其他兩組相比，MACC1蛋白表達(dá)水平降低，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平降低，而ERK1/2蛋白在3組細(xì)胞中表達(dá)的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2，表1)。

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后3組細(xì)胞MACC1、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達(dá)Fig.2 MACC1, ERK1/2 and p-ERK1/2 protein expression in each group by Western blot

表 1 各組細(xì)胞MACC1、ERK1/2和 p-ERK1/2表達(dá)Tab.1 MACC1, ERK1/2 and p-ERK1/2 protein expression in each group

2.3 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞增殖情況

據(jù)MTT檢測法顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖速度明顯低于陰性對照組和空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)染前后各組細(xì)胞順鉑耐藥性變化

據(jù)MTT檢測法顯示，實(shí)驗(yàn)組對順鉑的IC50為(26.094±0.911)μmol/L，分別低于空白組和陰性對照組［分別為(47.501±0.401)和(47.089±0.451)μmol/L］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 340.2，P＜0.05，圖4)。

圖 3 3組細(xì)胞的生長曲線Fig. 3 The growth curve of cells in each group

圖 4 3組細(xì)胞的順鉑敏感性Fig. 4 The chemosensitivity to cisplatin in each group

2.5 細(xì)胞凋亡率的變化

順鉑處理前、后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率高于空白組和陰性對照組(F=22.723，P＜0.05；F=256.568，P=0.000)。順鉑處理前實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率高于空白組及陰性對照組(P=0.001； P=0.002)；順鉑處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率也高于空白組及陰性對照組(P=0.000；P=0.000)；順鉑處理前后，陰性對照組和空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.224；P=0.096，圖5，表2)。

圖 5 MACC1沉默對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率的影響Fig. 5 The effect of MACC1 silencing on the apoptosis rate in SKOV3/DDP

表 2 MACC1沉默對SKOV3/DDP細(xì)胞凋亡率(%)的影響Tab. 2 The effect of MACC1silencing on the apoptosis rate (%) in SKOV3/DDP

3 討 論

腫瘤的形成因素之一是細(xì)胞內(nèi)原癌基因的激活和(或)抑癌基因的失活，使細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的失衡、細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制紊亂，而導(dǎo)致細(xì)胞過度增生和凋亡減少［3］。MACC1最初是Stein等［1］應(yīng)用qRT-PCR和數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)的一個與結(jié)腸癌密切相關(guān)的新基因，定位于人類染色體7p21.1，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼一個含852個氨基酸殘基的蛋白。MACC1是細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)/ c-Met信號傳導(dǎo)通路的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移及細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著極其重要的作用［4-5］。

近年研究表明，MACC1在多種惡性腫瘤(如結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌)中常高表達(dá)，可作為標(biāo)志轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的指標(biāo)［6-8］，提示MACC1的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)［9］，上皮性卵巢癌組織中存在MACC1的異常高表達(dá)；并成功構(gòu)建了MACC1特異性shRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌OVCAR3細(xì)胞使MACC1基因表達(dá)降低后，檢測到細(xì)胞增殖能力減弱、凋亡增加。Gao等［10］在肝細(xì)胞癌Huh7中沉默MACC1基因后，細(xì)胞的遷移、侵襲能力減弱。Pichorner等［11］構(gòu)建結(jié)直腸癌裸鼠移植瘤模型，轉(zhuǎn)染MACC1 shRNA后，移植瘤生長速度減慢，轉(zhuǎn)移能力減弱，說明在體內(nèi)試驗(yàn)中MACC1抑制能顯著抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNAi技術(shù)將重組質(zhì)粒p-super-EGFP-MACC1 shRNA轉(zhuǎn)染人卵巢癌耐藥細(xì)胞SKOV3/DDP，采用MTT法觀察MACC1基因沉默后細(xì)胞的增殖和對順鉑敏感性的變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率。發(fā)現(xiàn)MACC1沉默的細(xì)胞增殖明顯減慢，早期凋亡率增加，對順鉑的IC50降低，敏感性提高。以上研究均提示，在腫瘤細(xì)胞中抑制MACC1基因的表達(dá)，能使腫瘤細(xì)胞生長、侵襲轉(zhuǎn)移能力減弱。

MACC1對腫瘤細(xì)胞的這種調(diào)節(jié)作用可能是通過一系列細(xì)胞通路完成的。其中，ERK1/2信號通路可能發(fā)揮重要作用。ERK1/2信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的重要成員，能磷酸化激活多種轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的惡變等多種生物學(xué)反應(yīng)有關(guān)［12-13］。近來，許多研究者將ERK通路視為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)，如曹等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用ERK1/2通路抑制劑PD98059可增加乳腺癌細(xì)胞對表柔比星的敏感性［14］。探討MACC1與ERK1/2通路的關(guān)系時，Stein等［1］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染外源性MACC1后，HGF介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞播散作用可被ERK1/2通路抑制劑PD98059或UO126抑制，提示外源性MACC1高表達(dá)可激活ERK1/2信號通路。Wang等［15］在胰腺癌細(xì)胞中應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默MACC1基因后，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力減弱，對吉西他濱敏感性提高，p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌耐藥細(xì)胞中抑制MACC1基因表達(dá)后，不僅細(xì)胞增殖、凋亡能力及順鉑敏感性發(fā)生變化，p-ERK1/2蛋白表達(dá)也顯著降低。提示MACC1可能通過ERK1/2通路調(diào)控卵巢癌耐藥細(xì)胞的增殖、凋亡及順鉑敏感性。

結(jié)合以往研究及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，猜測MACC1可能作為ERK1/2通路的上游因子，調(diào)控卵巢癌的增殖及對順鉑的化療敏感性。這為下一步構(gòu)建動物模型，進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of MACC1 gene suppression on the proliferation of SKOV3/DDP cells and its chemosensitivity to cisplatin

DENG You-xing, SHI Hui-rong, LI Xia, ZHANG Rui-tao (Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou Henan 450052, China)

SHI Hui-rong E-mail: hrshi2011@163.com

Background and purpose: The metastasis-associated in colon cancer-1 (MACC1) is highly expressed in different cancers and has an effect on the proliferation and apoptosis of tumor cells through the regulation of extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2 pathway. However, the role of MACC1 in ovarian cancer has been rarely studied. The study was aimed to suppress MACC1 gene expression by siRNA and explore the relationship between MACC1 expression and chemosensitivity to cisplatin in ovarian cancer cell line SKOV3/DDP. Methods: Empty plasmid p-super-EGFP-1 (negative control group) and p-super-EGFP-MACC1 shRNA (experimental group) were transfected into ovarian cancer cell SKOV3/DDP respectively. SKOV3/DDP cells without transfection were used as blank group. Then, MACC1 mRNA and protein levels were measured by RT-PCR and Western blot, respectively. Cell proliferation and IC50 of cisplatin was determined by methyl thiazolyl tetrazolium test (MTT). Apoptosis rate was determined by flow cytometer (FCM). ERK1/2 and p-ERK1/2 protein levels were determined by Western blot. Results: Compared with those in blank and negative control groups, MACC1 mRNA and protein levels deceased in experimental group. The IC50 of cisplatin in experimental group was lower than that in the other groups (26.094 vs 47.501/47.089 μmol/L, P＜0.05). There was a lower expression of p-ERK1/2 in experimental group (0.3979 vs 00.6712/0.6681, P＜0.05). Apoptosis rate was significantly higher in the experimental group before and after treatment of cisplatin (1.32% vs 0.66%/0.48%, P＜0.05; 36.70% vs 18.53%/16.60%, P=0.000). Conclusion: MACC1 gene may be involved incisplatin resistance phenomenon in SKOV3/DDP cells through ERK1/2 pathway.

Metastasis-associated in colon cancer-1; Ovarian cancer; Cisplatin; Extracellular signal-regulated kinase

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.12.006

R737.31

A

1007-3639(2013)12-0967-07

2013-10-09

2013-11-30）

史惠蓉 E-mail:hrshi2011@163.com