趙宇清黃妍高蜀君豐有吉

1.復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011；

2.復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

3.上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200080

下調(diào)HOXB7基因?qū)β殉舶㏒KOV3細胞增殖的影響及機制探討

趙宇清1黃妍2高蜀君1豐有吉3

1.復(fù)旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011；

2.復(fù)旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復(fù)旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

3.上海市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200080

背景與目的：HOXB7基因在卵巢癌中過表達，可能與細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)。本研究采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)HOXB7基因表達，并探討其對卵巢漿液性囊腺癌SKOV3細胞增殖的影響及可能的機制。方法：將SKOV3細胞分為3組：空白組(未作轉(zhuǎn)染處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒pRNAT-neg)和HOXB7siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7)。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測干擾效應(yīng)。BrdU實驗檢測細胞增殖；流式細胞儀測定細胞周期、凋亡的變化；Western blot方法檢測與細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E的表達變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7到SKOV3細胞后，HOXB7基因的表達受到高效且特異的抑制(P＜0.01)；細胞增殖量減少；G1期阻滯，Cyclin D1、Cyclin E表達下降；細胞凋亡率增加。結(jié)論：HOXB7基因的表達下調(diào)可抑制SKOV3細胞增殖，其機制可能與轉(zhuǎn)錄下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、Cyclin E，使細胞周期阻滯在G1期有關(guān)；同時可促進其凋亡。

卵巢腫瘤；同源盒基因；增殖；細胞周期；Cyclin D1；Cyclin E

HOXB7基因?qū)偻串愋秃谢騂OX家族HOXB簇。目前認為，其作為一類特殊的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，不僅控制胚胎細胞的發(fā)育和分化，其過表達可能導(dǎo)致某些腫瘤的發(fā)生［1］，在白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、腸癌等腫瘤中均證實有HOXB7基因的高表達，并且與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲、血管生成有關(guān)［2-12］。也有研究結(jié)果表明：HOXB7基因在卵巢漿液性囊腺癌，內(nèi)膜樣癌中表達較正常卵巢組織高，且與卵巢癌的分級有關(guān)［13］，但其在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不明了。本研究應(yīng)用RNAi技術(shù)，將HOXB7基因的特異性小分子干擾RNA(siRNA)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入卵巢漿液性囊腺癌SKOV3細胞，以觀察阻斷HOXB7基因表達對細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響；同時檢測細胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E變化，初步了解其在卵巢癌中的分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢漿液性囊腺癌細胞株SKOV3購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)。細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、Opti-MEM購自美國Gibco公司，胎牛血清購自杭州四季清公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自美國Fermants公司。HOXB7兔抗人多克隆抗體購自美國ZYMED公司；兔抗人Cyclin D1和Cyclin E多克隆抗體購自美國Neomarkers公司；GAPDH鼠抗人單克隆抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰?；HRP標記羊抗兔、羊抗鼠IgG購自上海奇康生物科技公司。質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo購自美國GenScript公司。

1.2 方法

1.2.1 HOXB7siRNA表達載體構(gòu)建

HOXB7siRNA由載體pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒介導(dǎo)。根據(jù)siRNA設(shè)計原則和HOXB7基因mRNA編碼序列，選定特異性的HOXB7siRNA序列：AGAGTAACTTCCGGATCTA(GenBank編號NM_004502，362～380 bp)。對于選定的siRNA序列，合成兩條DNA模版單鏈，且每條單鏈均由siRNA的正義鏈與反義鏈組成。同時設(shè)計一條經(jīng)BLAST與現(xiàn)有基因文庫中所有人源基因均無同源性的非特異性序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)作為陰性對照。分別將根據(jù)每個序列合成的2條DNA模板單鏈退火后，插入空質(zhì)粒構(gòu)建成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒分別命名為pRNAT-hoxb7、pRNAT-neg(作為陰性對照)。經(jīng)上海博亞公司測序，鑒定正確后用于細胞轉(zhuǎn)染。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

SKOV3細胞在37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的條件下，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，以0.25%胰酶消化、傳代。

將培養(yǎng)的SKOV3細胞分3組：第1組為細胞未作轉(zhuǎn)染處理(空白組)；第2組為細胞轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒pRNAT-neg(陰性對照組)；第3組則為細胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7(pRNAT-hoxb7干擾組)。轉(zhuǎn)染前1天將SKOV3細胞接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染時細胞匯合至70%～80%時，按LipofectamineTM2000說明書的步驟分別轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7、陰性對照質(zhì)粒pRNAT-neg。24 h后，用0.2%胰蛋白酶消化，1∶10傳代于6.0 cm孔板中，48 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞熒光蛋白表達情況。高倍鏡下計數(shù)100個細胞計算細胞轉(zhuǎn)染陽性率。

1.2.3 RT-PCR檢測

分組同細胞轉(zhuǎn)染，SKOV3細胞在轉(zhuǎn)染72 h后，各組取1×106個細胞按照TRIzol說明書提取細胞總RNA，紫外分光光度儀定量。取4 μg總RNA按試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用不同引物進行PCR反應(yīng)。HOXB7上游引物：5’-AGAGTAACTTCCGGATCTA-3’，下游引物 5’-TCTGCTTCAGCCCTGTCTT-3’；擴增產(chǎn)物為274 bp。GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；下游引物：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’，擴增產(chǎn)物為450 bp。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應(yīng)體系用 GAPDH作為內(nèi)參照， PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外燈下觀察并拍照。Touching凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，以HOXB7與GAPDH條帶灰度值的比值作為HOXB7mRNA的相對表達水平。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

分組同細胞轉(zhuǎn)染，SKOV3細胞在轉(zhuǎn)染72 h后，蛋白裂解液裂解細胞并提取總蛋白，金雞鈉酸(bicinchonininc acid)法定量。30 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠分離后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉1 h，加入HOXB7多抗(1∶200)、Cyclin D1多抗(1∶200)、Cyclin E多抗(1∶200)、GADPH單抗(1∶10 000)，4 ℃溫育過夜，次日加入HRP標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗37 ℃溫育1 h。采用增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminescene，ECL)顯影。Touching凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值，并與GAPDH相比較計算相對表達水平。

1.2.5 BrdU檢測細胞增殖

分組同細胞轉(zhuǎn)染。SKOV3細胞在轉(zhuǎn)染72 h后，用10 nmol的BrdU標記細胞1 h，4%多聚甲醛室溫固定20 min。用2N的HCl 37 ℃處理1 h，0.1 mol/L的硼酸鈉(NaB4O7)室溫處理30 min，0.1%TritonX-100室溫處理2 min，10%小牛血清室溫下封閉1 h，加入BrdU單抗(1∶500)，4 ℃溫育過夜，次日再加入羊抗鼠二抗37 ℃溫育1 h，DAB顯色5 min，置顯微鏡下觀察。以細胞核呈黃色/棕黃色染色為陽性染色(為進行DNA合成的細胞)。每張片子隨機取5個高倍視野(×200)，計數(shù)陽性細胞所占的比例。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡

分組同細胞轉(zhuǎn)染。SKOV3細胞在轉(zhuǎn)染72 h，并經(jīng)消化、離心后(200×g，5 min，離心機型號：GB12258-1990)收集獲得，用70%冷乙醇4 ℃固定過夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次重懸細胞，加入500 μg/mL的PI和10 mg/mL的RNA酶A，37 ℃避光染色30 min，過濾后在流式細胞儀上檢測，每組檢測10 000個細胞，流式細胞儀自動檢測出每個細胞所處的細胞周期并分別計算出G1期、S期和G2/M期的細胞所占的百分比。

轉(zhuǎn)染72 h后棄上清液，冰預(yù)冷的1×PBS洗滌細胞2次，離心2 min后收集細胞，以1×106/ mL的濃度重懸于1×結(jié)合緩沖液中。取100 μL細胞懸液(1×105細胞)加入到5 mL的離心管中，分別加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI；輕輕振蕩混勻，室溫暗室溫育15 min。每管加入400 μL的 1×結(jié)合緩沖液，混勻，立即用流式細胞儀進行分析。結(jié)果分析：未凋亡的活細胞［AnnexinⅤ(-)/PI(-)］，早期凋亡細胞［AnnexinⅤ(+)/PI(-)］，晚期凋亡細胞和壞死細胞［AnnexinⅤ(+)/PI(+)］，機械損傷的細胞［AnnexinⅤ(-)/PI(+)］。本研究中，［AnnexinⅤ(+)/PI(-)］的細胞被認為是凋亡細胞，即早期凋亡細胞［14］。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有研究均設(shè)3份平行試驗，采用SPSS 11.5軟件對上述結(jié)果進行分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以表示，同組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞轉(zhuǎn)染情況

質(zhì)粒中含有編碼GFP的基因，故轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7到SKOV3細胞12 h后熒光顯微鏡下即可見綠色熒光細胞。48 h熒光達到明亮狀態(tài)，轉(zhuǎn)染48 h后熒光細胞陽性率為(80.5±3.5)%。

2.2 RNA干擾后HOXB7mRNA及蛋白抑制情況

SKOV3細胞分別經(jīng)陰性質(zhì)粒pRNAT-neg、干擾質(zhì)粒pRNAT-hoxb7轉(zhuǎn)染后，RT-PCR、Western blot方法檢測SKOV3細胞HOXB7mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示：①與空白組相比，陰性對照組細胞HOXB7 mRNA的表達無明顯變化，但pRNAT-hoxb7干擾組細胞HOXB7 mRNA的表達明顯下降，吸光度為陰性對照質(zhì)粒組的19%(圖1A)；②Western blot結(jié)果顯示，pRNAT-hoxb7干擾組細胞HOXB7 蛋白表達情況與mRNA表達一致，半定量分析表明，其蛋白表達量僅為陰性對照組的29%(圖1B)。

圖 1 轉(zhuǎn)染HOXB7siRNA到SKOV3細胞后HOXB7mRNA和蛋白表達變化Fig. 1 Transfection with HOXB7 siRNA plasmids(pRNAT-hoxb7) to knonck down HOXB7 gene in SKOV3 cell line

2.3 RNA干擾后，SKOV3細胞增殖率的改變

采用BrdU法分別檢測SKOV3細胞空白組、陰性對照組、pRNAT-hoxb7干擾組細胞增殖率的變化。BrdU陽性的細胞核呈均一的棕黃色，為增殖的細胞，而BrdU陰性的細胞核則被蘇木素復(fù)染為藍色。計數(shù)5個高倍鏡視野中陽性細胞所占百分比即代表各組細胞的增殖率。結(jié)果顯示，pRNAT-hoxb7干擾組的SKOV3細胞增殖率為(22.78±2.08)%，明顯低于空白組(35.40±1.95)%和陰性對照組(33.13±2.19)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 干擾HOXB7表達后對人卵巢癌細胞系SKOV3細胞周期的影響

應(yīng)用流式細胞儀分析細胞的細胞周期。結(jié)果顯示，與空白組和陰性對照組相比，pRNAT-hoxb7干擾組G1期細胞所占比例增加，而S期細胞所占比例減少，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，表1)。

表 1 流式細胞儀檢測RNA干擾前后卵巢癌SKOV3細胞周期的變化Tab. 1 Effects of HOXB7 depletion on SKOV3 cell cycle distribution

2.5 干擾HOXB7表達后SKOV3細胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表達變化

為進一步研究RNA干擾HOXB7基因引起SKOV3細胞S期變化的機制，本研究采用Western blot法檢測了與細胞增殖和細胞周期有關(guān)的Cyclin D1和Cyclin E蛋白在各組細胞中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白組和陰性對照組相比，pRNAT-hoxb7干擾組Cyclin D1和Cyclin E蛋白表達水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而內(nèi)參照GAPDH在各組中的表達水平相似(圖2)。

2.6 HOXB7 siRNA對SKOV3細胞凋亡的影響

細胞凋亡時，膜磷脂中的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)從細胞膜的內(nèi)表面移到外表面，AnnexinⅤ與PS有高度的親和力，因而能識別凋亡細胞。PI是流式細胞儀分析的顯色劑。本研究中SKOV3細胞用AnnexinⅤ和PI雙染色，通過流式細胞儀分析細胞的凋亡。結(jié)果顯示，pRNAT-hoxb7干擾組的SKOV3細胞凋亡率為(5.54±0.61)%，高于空白組(2.50±0.59)%和陰性對照組(3.33±0.25)%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

圖 2 Western blot 檢測HOXB7 siRNA作用后，ES-2、SKOV3細胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表達變化Fig. 2 Western blot analysis of Cyclin D1 and Cyclin E after transfection of siRNA for 72 h

圖 3 流式細胞儀檢測RNA干擾HOXB7后ES-2、SKOV3細胞凋亡的變化Fig. 3 The effects of siRNA on apoptosis of SKOV3 cells in the lower right quadrant [Annexin V(+)/PI(-)] were viable apoptosis cells

3 討 論

卵巢漿液性囊腺癌占卵巢惡性腫瘤的40%～50%，惡性程度較高、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，目前對其發(fā)生的分子機制尚不完全明了。近年有文獻報道了作為胚胎發(fā)育主控基因的HOX基因參與了卵巢腫瘤的發(fā)生。如HOXA7與高分化卵巢癌或癌腫早期發(fā)生有關(guān)，可作為卵巢癌早期診斷的標志［15］；HOXA9、HOXA10、HOXA11可能與誘導(dǎo)上皮性卵巢癌向不同病理類型分化(漿液性、內(nèi)膜樣、黏液性)有關(guān)［16］。

HOXB7基因?qū)偻串愋秃谢騂OX家族，定位于染色體17q21.3。目前，HOXB7基因與卵巢癌關(guān)系的研究尚少，Naora等［13］用SEREX方法檢測卵巢正常上皮，卵巢漿液性囊腺癌，內(nèi)膜樣癌患者血清中HOXB7表達及Western blot檢測相應(yīng)組織中HOXB7蛋白質(zhì)表達，提示HOXB7在上述腫瘤組織中高表達；將HOXB7正義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入卵巢永生化上皮細胞中，細胞增殖率增加3倍，同時伴隨細胞分泌堿性成纖維因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)增多，提示HOXB7基因可能是通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)bFGF分泌進而促進卵巢表面上皮細胞的增生。

為研究 HOXB7基因與卵巢癌細胞周期及相關(guān)機制，本部分實驗選擇了陽性表達HOXB7基因的卵巢漿液性囊腺癌細胞SKOV3。應(yīng)用pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒構(gòu)建HOXB7siRNA表達載體，并轉(zhuǎn)入到上述細胞中；經(jīng)RT-PCR和Western blot技術(shù)驗證，其能有效阻斷HOXB7基因的表達。隨后，采用BrdU法和流式細胞儀分別檢測干擾前后細胞增生能力及細胞周期的變化，以觀察HOXB7基因?qū)β殉矟{液性囊腺癌體外細胞增生的影響。結(jié)果顯示，RNA干擾使HOXB7基因表達沉默能夠顯著抑制SKOV3細胞的增殖，并且使其S期細胞比例下降，G1期細胞比例增加，細胞周期阻滯在G1期。

為了進一步探討HOXB7基因沉默導(dǎo)致細胞生長受抑和G1期阻滯的機制，本研究檢測了在細胞增殖和細胞周期調(diào)控中起主要作用的Cyclin D1和Cyclin E蛋白在HOXB7基因干擾前后的表達變化。Cyclin D1和Cyclin E都是G1期相關(guān)的細胞周期蛋白，在G1/S期轉(zhuǎn)變過程中起重要作用［17］。正常細胞的增殖分化有賴于細胞有序的周期活動，Cyclin D1定位于染色體11q13，與CDK4/CDK6結(jié)合而形成復(fù)合物，使Rb發(fā)生磷酸化而與E2F分離，驅(qū)動細胞由G1期進入S期，促進細胞增殖。當Cyclin D1或CDK4/CDK6表達失控時，可能導(dǎo)致細胞增殖周期失調(diào)，腫瘤發(fā)生。Cyclin E定位于染色體19q12～19q13，與細胞周期素依賴性激酶2(CDK2)結(jié)合并使之激活，在G1晚期調(diào)控和G1/S期轉(zhuǎn)換過程中起關(guān)鍵作用，可促使細胞由G1期進入S期。Cyclin E異常表達可使CDK2持續(xù)激活，細胞周期失控而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。許多惡性腫瘤均有Cyclin D1、Cyclin E的高表達，如乳腺癌、肝癌、頭頸部腫瘤等，卵巢癌亦不例外［17］。本研究發(fā)現(xiàn)干擾HOXB7基因后，SKOV3細胞中的Cyclin D1和Cyclin E表達水平明顯降低；提示在卵巢癌中，RNA干擾HOXB7基因表達所致細胞增生能力下降可能與Cyclin D1和Cyclin E降低有關(guān)，但具體通過何途徑調(diào)節(jié)尚需進一步研究。

目前有關(guān)HOXB7基因與卵巢癌凋亡關(guān)系的研究尚鮮見報道。本研究應(yīng)用流式細胞儀檢測了RNA干擾HOXB7基因?qū)β殉舶㏒KOV3細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，RNA干擾使HOXB7基因表達沉默，促進卵巢癌SKOV3細胞凋亡，但具體機制尚待進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，HOXB7基因在卵巢漿液腺囊腺癌細胞株中呈陽性表達；應(yīng)用構(gòu)建真核表達載體的RNA干擾技術(shù)能特異并有效地沉默HOXB7基因的表達，為研究其功能提供了一個理想的技術(shù)平臺；阻斷HOXB7基因在卵巢癌中表達可抑制卵巢癌細胞的惡性增殖，促進其凋亡，且抑制卵巢癌細胞的惡性增殖可能與下調(diào)細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表達有關(guān)，為進一步開展卵巢癌的基因治療奠定了基礎(chǔ)。另外，涉及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因和影響因素決不是單一的，為了更好地了解HOXB7在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，有必要進一步研究HOXB7與其他調(diào)節(jié)增殖、侵襲相關(guān)基因之間的關(guān)系。

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Silencing of HOXB7 by RNAi influences proliferation and relative mechanism of ovarian serous adenocarcinoma cell line SKOV3

ZHAO Yu-qing1, HUANG Yan2, GAO Shu-jun1, FENG You-ji3(1. Department of Gynecology and Obstetrics, Gynecologic and Obstetric Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China; 2. Department of Gynecologic Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, and Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 20032, China; 3. Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai 20080, China) Correspondence to: FENG You-ji E-mail: fengyj4806@sohu.com

Background and purpose: The expression of HOXB7 gene was higher expressed in ovarian cancer and may be involved in the cellular malignant transformation.This study used the sequence-specific siRNA knocking down the expression of HOXB7 gene and aimed to investigate its effect on cell proliferation and relative mechanism of ovarian serous adenocarcinoma cell line SKOV3. Methods: SKOV3 cells were divided into 3 groups: untreated control group, non-specific siRNA group transfected with unrelated siRNA (pRNAT-neg) and HOXB7siRNA groups transfected with HOXB7s-iRNA (pRNAT-hoxb7). RT-PCR, Western blot were used to examine the HOXB7mRNA and protein expression. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. We further investigated the expression of Cyclin D1, Cyclin E by Western blot, which were critical in regulating cell proliferation. Results: The pRNAT-hoxb7 siRNA had high inhibition for HOXB7 gene (P＜0.01). HOXB7 RNAi could also arrest of G1cell cycle, induce inhibition of cell proliferation and increase apoptosis rate. Western blot showed the expression of Cyclin D1, Cyclin E decreased after HOXB7 expression downregulated. Conclusion: Down-regulated HOXB7 expression could inhibit the expression of Cyclin D1, Cyclin E and thus is involved in the G1arrest and may increase the apoptosis rate of SKOV3 cells.

Ovarian neoplasms; Homeobox gene; Proliferation; Cell cycle; Cyclin D; Cyclin E

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.003

R737.31

：A

：1007-3639(2013)03-0173-06

2012-12-19

2013-03-01）

豐有吉 E-mail:fengyj4806@sohu.com