新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830054

肝細(xì)胞癌組織中高爾基體糖蛋白73和分泌型聚集素的表達(dá)及其相關(guān)性分析

曹茜 古麗比也·沙比爾 楊穎 肖蕾 毛睿 張瑞麗 張華 包永星

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，新疆 烏魯木齊 830054

背景與目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種具有高度侵襲、轉(zhuǎn)移性的常見惡性腫瘤，預(yù)后極差。因此，研究肝癌侵襲的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)顯得尤為重要。一些研究提示分泌型聚集素(secreted Clusterin，sCLU)和高爾基體糖蛋白73(Golgi glycoprotein 73，GP73)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，且兩者具有結(jié)構(gòu)和功能上的相似性。本研究旨在探討GP73和sCLU在HCC中的表達(dá)及其與臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系。方法：收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院75例HCC患者癌組織及癌旁正常肝組織標(biāo)本，采用免疫組化(EnVision二步法)檢測HCC組織中GP73、sCLU的表達(dá)水平；并與癌旁正常肝組織相比較；Spearman等級(jí)相關(guān)分析GP73和sCLU在肝癌中表達(dá)的關(guān)系；研究GP73和sCLU表達(dá)水平與HCC臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：GP73和sCLU在HCC中陽性表達(dá)率分別為72%和88%，癌旁正常肝組織的陽性表達(dá)率均為4%。GP73在HCC和正常肝組織中陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=73.60，P＜0.05)。sCLU在HCC和正常肝組織中陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=207.94，P＜0.05)；Spearman等級(jí)相關(guān)分析提示，HCC組織中，GP73和sCLU蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.405，P＜0.05)；GP73和sCLU在HCC中表達(dá)水平與腫瘤的Edmondson病理分級(jí)、TNM分期及血管侵犯相關(guān)(P＜0.05)，而與患者的性別、年齡、HBsAg、合并肝硬化、AFP值、門靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目無相關(guān)性(P＞0.05)；GP73表達(dá)與患者生存期有關(guān)，而sCLU表達(dá)與患者生存期無關(guān)。結(jié)論：GP73和sCLU在肝癌中有較高的陽性率，且GP73和sCLU表達(dá)呈正相關(guān)，GP73和sCLU可能與HCC的侵襲性等生物行為密切相關(guān)，檢測其表達(dá)將有助于評(píng)價(jià)患者預(yù)后。

肝細(xì)胞癌；高爾基體糖蛋白73；分泌型聚集素；侵襲；預(yù)后

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見的惡性腫瘤，預(yù)后較差，在全球惡性腫瘤的致死原因中位居第3位［1］。導(dǎo)致肝癌預(yù)后極差的主要原因是肝癌具有高度侵襲、轉(zhuǎn)移能力［2］，因此研究肝癌侵襲的機(jī)制，尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)顯得尤為重要。高爾基體糖蛋白73(Golgi glycoprotein 73，GP73)是一種高爾基體分泌性糖蛋白，在多種上皮細(xì)胞中表達(dá)，參與上皮細(xì)胞的多項(xiàng)生理及病理活動(dòng)［3］。相關(guān)研究提示GP73在HCC中表達(dá)明顯上調(diào)［4-5］，且與血管浸潤、腫瘤分期有關(guān)［6］，由此推測GP73可能參與HCC的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的過程。最新研究證實(shí)GP73和同樣定位于高爾基體的分泌型聚集素(secreted Clusterin，sCLU)功能相似［7］。sCLU是一種硫化異二聚體糖蛋白，幾乎表達(dá)于所有的組織和體液中［8］。研究發(fā)現(xiàn)sCLU在腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要作用［9］。本研究通過檢測GP73和sCLU在HCC中的表達(dá)水平，探討其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，以及GP73和sCLU與HCC生物學(xué)行為的潛在相關(guān)性。

1 資料和方法

1.1 研究資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行手術(shù)切除、臨床資料完整且剔除失訪的肝癌患者組織標(biāo)本及其癌旁正常肝組織標(biāo)本75例。所有標(biāo)本均由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬院病理科提供。所有患者術(shù)前均未行放療、化療或介入治療且術(shù)后病理學(xué)確診為HCC。根據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)(UICC)2011年TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，75例HCC標(biāo)本中Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期54例。根據(jù)Edmondson分級(jí)法，HCC標(biāo)本中，Ⅰ～Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)60例。經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得患者的知情同意后，從本院病案室調(diào)閱病歷資料，包括性別、年齡、肝硬化程度、腫瘤大小、數(shù)目、TNM分期、血清AFP水平、腫瘤病理分級(jí)、有無血管侵犯、有無門靜脈癌栓等。對(duì)患者進(jìn)行隨訪，并繪制生存曲線。

1.2 主要試劑及器材

兔抗人GP73多克隆抗體購自美國Proteintech Group公司。兔抗人sCLU多克隆抗體購自武漢博士德公司。免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。其他試劑包括PBS緩沖液、抗原修復(fù)液、枸櫞酸抗原修復(fù)液等。其他儀器包括LEICA DM3000顯微鏡、微波爐、恒溫培養(yǎng)箱SLI-700、冰箱、切片機(jī)、攤片機(jī)等。

1.3 染色方法

采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。HCC標(biāo)本以4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋。蠟塊以5 μm厚連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟，水化，先后經(jīng)3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，微波爐枸櫞酸液修復(fù)。每批實(shí)驗(yàn)設(shè)陽性和陰性對(duì)照。陽性對(duì)照是用含有靶抗原的切片進(jìn)行對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)采取的陽性靶抗原為GP73蛋白和sCLU蛋白。實(shí)驗(yàn)過程中加入兔抗人GP73多克隆抗體(一抗)和兔抗人sCLU多克隆抗體(一抗)進(jìn)行免疫組化反應(yīng)。其中GP73一抗工作液濃度為1∶50，sCLU一抗工作液濃度為1∶200。陰性對(duì)照是以PBS液取代一抗作陰性對(duì)照。加入一抗后將反應(yīng)體系置于4 ℃冰箱過夜。次日滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(免疫組化試劑盒中提供的二抗)，后采用DAB顯色10～15 s，顯微鏡下觀察染色程度，用自來水終止顯色。最后蘇木素復(fù)染，中性樹脂膠封片。

1.4 結(jié)果判定

以細(xì)胞質(zhì)顯色為棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。選取切片染色對(duì)比度較好，背景清晰，定位準(zhǔn)確及排除出血、壞死部位和切片邊緣，在LEICA DM3000顯微鏡下觀察整張切片染色情況，統(tǒng)一光源、光圈亮度、對(duì)比度、色彩飽和度，關(guān)閉白平衡，拍攝照片，將照片儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中，由2位病理科醫(yī)生根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行雙盲結(jié)果判定，按著色強(qiáng)度給與組織評(píng)分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。在高倍視野下(400×)隨機(jī)選取5個(gè)視野(每個(gè)視野觀察不少于100個(gè)細(xì)胞)，用Image-Pro Puls圖像分析軟件測定每張照片的陽性細(xì)胞百分比。按陽性細(xì)胞百分比給組織評(píng)分：無陽性細(xì)胞計(jì)為0分，1%～20%為1分，21%～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分。兩項(xiàng)得分相乘，0～1分為“–”，2～4分為“+”；5～7分為“++”；8分以上為“+++”。本研究將“–、+”定義為蛋白低表達(dá)組即陰性組，“++、+++”定義為蛋白高表達(dá)組即陽性組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各指標(biāo)在兩組之間陽性表達(dá)率的比較采用四格表Z檢驗(yàn)，當(dāng)理論值較小時(shí)，采用校正四格表χ2檢驗(yàn)。各指標(biāo)蛋白表達(dá)量在兩組間的比較服從正態(tài)性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)性檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier法，對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)log-rank test比較生存曲線的差別。指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GP73和sCLU在HCC和癌旁肝組織中的表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，GP73和sCLU在肝細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，顏色為棕黃色。HCC組織中GP73陽性表達(dá)率為72.00%(54/75)，sCLU 陽性表達(dá)率為88.00%(66/75)。癌旁正常肝組織中GP73和sCLU陽性表達(dá)率均為4.00%(3/75)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：HCC組織中GP73陽性率高于癌旁肝組織(χ2=73.60，P＜0.05)，HCC組織中sCLU陽性率也高于癌旁肝組織(χ2=207.94，P＜0.05，圖1)。

圖 1 GP73和sCLU在HCC和癌旁肝組織中的表達(dá)Fig. 1 The expression of GP73 and sCLU in HCC and normal liver tissues

2.2 肝癌組織中GP73和sCLU表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，HCC標(biāo)本中，GP73和sCLU表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.405，P＜0.05)。

2.3 GP73和sCLU表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)HCC中GP73和sCLU表達(dá)水平與腫瘤的Edmondson病理分級(jí)、TNM分期及血管侵犯相關(guān)(P均＜0.05)，而與患者的性別、年齡、HBsAg、合并肝硬化、AFP值、門靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目均無關(guān)(P＞0.05，表1)。

2.4 GP73和sCLU與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪75例HCC患者，GP73陽性組54例，中位生存時(shí)間為7個(gè)月；陰性組21例，中位生存時(shí)間為13個(gè)月，繪制Kaplan-Meier生存曲線并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果表明GP73陽性組與陰性組生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=28.72，P＜0.05)。sCLU陽性組66例，中位生存時(shí)間為8個(gè)月；陰性組9例，中位生存時(shí)間為9個(gè)月。生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)表明：sCLU陽性組與陰性組生存時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.661，P＞0.05，表2，圖2)。

表 1 肝癌組織中GP73和sCLU表達(dá)與臨床病理資料關(guān)系Tab. 1 The correlation between GP73 and sCLU with clinicpathologic features

表 2 GP73和sCLU生存期的比較Tab. 2 Survival time of HCC patients by GP73 and sCLU

圖 2 肝癌患者生存曲線圖Fig. 2 The survival curves of HCC patients

3 討 論

2000年，美國學(xué)者Kladney等［10］在研究成人巨大細(xì)胞性肝炎病原學(xué)時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了GP73。健康人肝細(xì)胞很少表達(dá)GP73，而在肝臟出現(xiàn)急慢性炎性反應(yīng)或肝纖維化時(shí)，表達(dá)明顯上調(diào)，發(fā)展到HCC時(shí)，GP73的表達(dá)達(dá)到高峰［11］。近年來在一項(xiàng)多中心、大樣本、多人種的國際性研究中提出GP73診斷肝癌的敏感度和特異度均高于AFP，可作為肝癌早期診斷的新型腫瘤分子標(biāo)志物［4］。但目前對(duì)于GP73的研究多停留在作為血清腫瘤標(biāo)志物的方向，而其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制及功能的報(bào)道均較少見。

研究提示GP73和sCLU存在結(jié)構(gòu)和功能上的相似之處。二者均定位于高爾基體；GP73基因的C末端截短的小鼠患有局灶性節(jié)段性腎小球硬化，而敲除sCLU基因后出現(xiàn)進(jìn)展性腎小球硬化［3］。本研究通過免疫組化方法在組織水平上發(fā)現(xiàn)HCC組織中GP73和sCLU蛋白陽性表達(dá)率均高于癌旁正常肝組織，Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，HCC中GP73和sCLU表達(dá)呈正相關(guān)。基于以上研究結(jié)果，我們考慮GP73和sCLU在調(diào)控機(jī)制上存在相關(guān)性和重疊性。

目前研究認(rèn)為sCLU是一種硫化異二聚體糖蛋白，在多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起著重要的作用［12-13］。熊茂明等［14］也提出sCLU與肝癌分化程度有關(guān)。本研究證實(shí)，GP73和sCLU與腫瘤病理分級(jí)、血管侵犯以及腫瘤分期明顯相關(guān)。考慮到GP73與sCLU的相互關(guān)系，推測GP73可能與sCLU一樣參與了肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。

對(duì)75例HCC患者隨訪結(jié)果顯示，GP73陽性組與陰性組生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明HCC組織中GP73表達(dá)高的患者生存期短，由此可見，檢測GP73可能有助于判斷HCC的預(yù)后。

綜上所述，GP73是極具研究價(jià)值的分子靶點(diǎn)。檢測GP73在HCC中的表達(dá)，可以作為判斷肝癌的惡性程度、侵襲性及預(yù)后的重要參考指標(biāo)，這將有助于指導(dǎo)臨床治療及評(píng)估病情。鑒于目前對(duì)于sCLU和GP73的分子生物學(xué)特性仍知之甚少，如阻斷其表達(dá)是否可達(dá)到治療HCC的目的等，還有待進(jìn)一步深入研究。

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Expression of Golgi glycoprotein 73 and secreted Clusterin in hepatocellular carcinoma

CAO Qian, SHABIER Gulibiye, YANG Ying, XIAO Lei, MAO Rui, ZHANG Rui-li, ZHANG Hua, BAO Yong-xing (Tumor Center, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi Xinjiang 830054, China)

BAO Yong-xing E-mail: baoyx@vip.sina.com

Background and purpose: Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common cancer with poor prognosis. The main reason leading to the poor prognosis of HCC is the highly invasive and metastatic ability. Therefore, trying to know the mechanism of HCC invasion and getting an effective interventions target is very important. Some studies suggest that secreted clusterin (sCLU) and Golgi glycoprotein 73 (GP73) played important roles in the development of tumour process, and both of them have structural and functional similarities. The aim of the article was to investigate the expression of GP73 and sCLU in HCC and their relationship with the clinicopathological features and the prognosis, and finally to evaluate the value of them. Methods: Seventy-five cases of HCC were collected. Immunohistochemistry (IHC) was used to determine the expression of GP73 and sCLU in HCC and normal liver tissues. Spearman rank was used to analyze the correlation between GP73 and sCLU in HCC. The relationship of GP73 and sCLU expression with the clinicopathological features and the prognosis was investigated. Results: The positive rates of GP73 and sCLU in HCC were 72% (54/75) and 88% (66/75) respectively; but in normal liver tissues,it was 4% (3/75). GP73-positive rate in HCC was higher than that of the normal liver tissues (χ2=73.60, P＜0.05). sCLU-positive rate in HCC was also higher than that of the normal liver tissues (χ2=207.94, P＜0.05). GP73 expression was positively correlated with sCLU expression in HCC (r=0.405, P＜0.05). GP73 and sCLU were associated with clinicopathological features including tumor differentiation, TNM stage and vascular invasion (P＜0.05); GP73 and sCLU had no correlation with the patient’s gender, age, HBsAg, cirrhosis, AFP value, portal vein thrombosis and tumor numbers (P＞0.05). GP73 was associated with survival but not sCLU. Conclusion: GP73 and sCLU have higher positive rates in HCC and GP73 is positively correlated with sCLU. The expression of GP73 and sCLU are probably closely related with the invasion of HCC, which can help evaluate the prognosis of the patients.

Hepatocellular carcinoma; Golgi glycoprotein 73; Secreted Clusterin; Invasion; Prognosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.005

R735.7

：A

：1007-3639(2013)11-0880-05

2013-08-05

2013-10-12）

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃感染與腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(No：H111313001)；吳階平基金會(huì)臨床研究課題(No：320.6799.1138)；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研專項(xiàng)基金(No：2012，YFY07)。

包永星 E-mail:baoyx@vip.sina.com