高敬賢王青春查干阿爾斯楞白長喜

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

有氧運動對中年Ⅱ型糖尿病雌性大鼠的影響

高敬賢1王青春2查干阿爾斯楞1白長喜1

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193

目的：觀察游泳運動對不同階段Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白表達的影響，為Ⅱ型糖尿病的治療提供理論依據(jù)。方法：雌性SD大鼠隨機分為3組，第9周初對糖尿病治療組進行小劑量STZ注射，引發(fā)Ⅱ型糖尿病，并開始對糖尿病治療運動組進行為期8周的游泳運動。在第16周末取材對骨骼肌瘦素受體蛋白含量、胰島素、血糖、體重等指標(biāo)進行測定。結(jié)果：糖尿病治療對照組骨骼肌瘦素受體蛋白含量下降（P＜0.05），空腹胰島素、血糖均升高（P＜0.01）；游泳運動后，治療糖尿病運動組骨骼肌瘦素受體蛋白含量升高（P＜0.05）；空腹胰島素和血糖均下降（P＜0.05）。結(jié)論：小劑量STZ和高脂膳食共同作用可成功誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，機體出現(xiàn)胰島素抵抗伴有瘦素抵抗；有氧運動使大鼠體內(nèi)骨骼肌瘦素受體蛋白含量增加，瘦素敏感性升高，改善Ⅱ型糖尿病的胰島素抵抗和瘦素抵抗，對Ⅱ型糖尿病起到一定的治療作用。

有氧運動；Ⅱ型糖尿??；胰島素；血糖；骨骼肌瘦素受體

Ⅱ型糖尿病占糖尿病總數(shù)的90%，發(fā)病基礎(chǔ)除胰島素抵抗之外，肥胖也是Ⅱ型糖尿病的又一危險因素［1］。瘦素是由肥胖基因編碼、脂肪組織分泌的蛋白類激素，在Ⅱ型糖尿病的發(fā)展過程中，瘦素分泌比正常水平要高，而瘦素可通過外周途徑紊亂機體對糖、脂肪代謝。機體骨骼肌、肝臟、脂肪組織是瘦素和胰島素作用的重要靶器官，瘦素受體表達減弱可使瘦素不能與瘦素受體結(jié)合發(fā)揮正常的生理作用，對外周組織的代謝調(diào)節(jié)作用受損，是造成胰島素抵抗的又一因素［2－4］。

瘦素及其骨骼肌上的受體與Ⅱ型糖尿病的關(guān)系仍在探索之中，它們在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到什么樣的作用，能否用運動改善骨骼肌等外周組織瘦素受體蛋白的表達，改善瘦素抵抗，升高機體對瘦素敏感性，從而改善Ⅱ型糖尿病機體內(nèi)發(fā)生的胰島素抵抗現(xiàn)象，具有一定的學(xué)術(shù)價值，也具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 研究對象 10月齡雌性SD大鼠，由沈陽雙義實驗動物研究所提供。

1.2 方法步驟

1.2.1 Ⅱ型糖尿病模型的建立 42只10月齡雌性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分3組：正常對照組、糖尿病治療對照組、糖尿病治療運動組并分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。正常對照組喂基礎(chǔ)飼料，其余2組高脂飼料喂養(yǎng)。每天記錄大鼠的攝食量，每周定時測體重。8周后，以35mg／kg的劑量對糖尿病治療組大鼠腹腔內(nèi)一次性注射鏈脲佐菌素（STZ），在72小時后尾靜脈進行取血，測血糖，當(dāng)血糖值≥16.7mmol／L時表明Ⅱ型糖尿病大鼠造模成功，如果血糖值＜16.7mmol／L則繼續(xù)注射鏈脲佐菌素，直至≥16.7mmol／LⅡ型糖尿病模型確立為止。

1.2.2 游泳運動 給運動組進行8周自由游泳運動。泳池水深度為50cm，每只動物約占有350mm2的活動表面積。水溫32～36℃。前2天試游10min，逐漸加量，前2周每天游40min，第7、8周按10min／40g體重定游泳時間，每周6天。

1.2.3 收集標(biāo)本 大鼠結(jié)束運動24h后，禁食12h，腹腔內(nèi)以（1.5g／kg）注射氨基甲酸乙酯麻醉，尾部取血制血清（測血清胰島素、血糖用）。收集血清：3500rpm離心10min，分離血清。后腹腔內(nèi)注射胰島素（3.3U／kg），尾部取血測血糖。分離腓腸?。ㄒ詼y定骨骼肌瘦素受體蛋白含量）。密封于－80℃冰箱保存，待測。

1.2.4 指標(biāo)檢測

1.2.4.1 空腹血糖的測定：使用血糖儀測定。

1.2.4.2 血清胰島素的測定：用放射免疫法。操作步驟：試劑充分溶解，平衡至室溫后，按表1順序加樣并操作。結(jié)果由自動γ計數(shù)器預(yù)先編制程序，直接給出有關(guān)參數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

表1 胰島素放免分析操作程序表（ul）

1.2.4.3 測骨骼肌瘦素受體蛋白 （1）蛋白提?。喝∫旱袃龃娴臉?biāo)本，剪碎組織塊，加冰預(yù)冷的細(xì)胞裂解液200μL，冰水浴中超聲粉碎。4℃，12000rpm離心1h，取上清。

（2）測定蛋白濃度：參考試劑盒說明，用考馬斯亮藍法。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為0.56mg／mL，加考馬斯亮藍G250后室溫靜置10min，于595nm處測各管吸光度。根據(jù)檢測的結(jié)果，用裂解緩沖液調(diào)整各標(biāo)本至相同的蛋白濃度。

蛋白含量（mg／ml）＝OD標(biāo)本／OD標(biāo)準(zhǔn)品×標(biāo)準(zhǔn)濃度

（3）蛋白的變性：取標(biāo)本蛋白100μL，加100μL樣品緩沖液，煮沸5分鐘。

（4）配膠：①10%分離膠10ml：Acr 3.2mL，Tris／HCL緩沖液（PH8.8）2.5mL，蒸餾水4mL，APS 50μL，SDS 100μL，TEMED 20μL。②4%濃縮膠10mL：Acr 1.4mL，Tris／HCL緩沖液（PH6.8）2.5mL，蒸餾水6mL，APS 0.1mL，SDS 0.1mL，TEMED 20μL。灌注分離膠后，加少量去離子水，室溫下充分聚合后，傾去去離子水，用濾紙吸干，灌注濃縮膠，聚合后，拔出梳子。各標(biāo)本蛋白上樣50μL。

（5）電泳：上清用12%SDS－PAGE分離，BIO－RAD電泳板，雙板條件為150V，30mA，2小時。

（6）轉(zhuǎn)印、封閉：硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)印液中平衡10分鐘，然后膠在負(fù)極，膜在正極的原則，經(jīng)2小時50V的轉(zhuǎn)印后TTBS洗膜1次。用含5%去脂奶粉TTBS封閉4℃過夜。

（7）：孵育：取出膜后，TBS洗膜5分鐘×3次，加一抗（1：400），室溫下2h。加堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗（1：2000），室溫下2h。

（8）清洗顯色：TTBS洗5分鐘×2次，TBS洗5分鐘×1次。然后用酶顯法顯色。

（9）Western Blot結(jié)果量化分析：采用FlourChem V2.0凝膠成像分析軟件（America）分析，記錄每條蛋白電泳帶灰度值，進行定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，所有數(shù)據(jù)用±s來表示，用t檢驗兩組間比較，用方差分析對多組進行比較用。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料喂養(yǎng)后各組大鼠體重的變化 由表2可知，經(jīng)八周高脂飼料飼養(yǎng)養(yǎng)后，糖尿病治療模型組體重顯著高于基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)養(yǎng)的正常對照組（P＜0.01）。糖尿病治療模型組體重均高于正常組體重25%以上，根據(jù)肥胖的標(biāo)準(zhǔn)達到了肥胖。

表2 高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠體重變化（±s）

表2 高脂飼料喂養(yǎng)各組大鼠體重變化（±s）

注：與正常對照組比較：＃P＜0.01

組別動物數(shù)（只）體重（g）14264.70±8.65糖尿病治療對照組14342.05±17.78＃糖尿病治療運動組14338.76±28.06正常對照組＃

2.2大鼠空腹胰島素、血糖的變化由表3可知，治療糖尿病對照組空腹胰島素、血糖水平升高且有顯著性差異（P＜0.01）。糖尿病治療運動組空腹血糖下降（P＜0.05），空腹胰島素下降（P＜0.05）有顯著性差異。

2.3 大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白變化 從表4可知，糖尿病治療對照組骨骼肌瘦素受體蛋白含量下降有顯著性差異（P＜0.05）；治療運動組與其相應(yīng)的對照組比較：骨骼肌瘦素受體蛋白含量升高并有顯著性差異（P＜0.05）。

表3 空腹胰島素、血糖的變化（±s）

表3 空腹胰島素、血糖的變化（±s）

注：與正常對照組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；治療運動組與治療對照組比較：★P＜0.05，★★P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）FINS（mmol／l）FBG（mmol／l）144.76±0.4440.94±13.29糖尿病治療對照組1419.94±2.13＃＃77.42±16.06＃＃糖尿病治療運動組1411.38±6.66★49.88±14.93正常對照組★

表4 大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白變化

3 討論

3.1 Ⅱ型糖尿病模型的建立 國內(nèi)外學(xué)者已證實，高熱量飲食＋STZ注射是制造Ⅱ型糖尿病大鼠模型的重要條件。小劑量STZ可選擇性損傷胰島細(xì)胞，導(dǎo)致高血糖；高熱量飲食可導(dǎo)致肥胖，肥胖可引起胰島素抵抗，產(chǎn)生高胰島素血癥、血脂紊亂等一系列Ⅱ型糖尿病臨床特征。兩者聯(lián)合作用可以成功誘導(dǎo)出具有高血糖特征和胰島素抵抗的Ⅱ型糖尿病大鼠模型［5－7］。該模型模擬了中老年人經(jīng)典Ⅱ型糖尿病自然病程（使用的STZ劑量以大鼠體重35 mg／kg為最適宜）［8］。

實驗先將糖尿病治療組大鼠高脂飼料喂養(yǎng)8周，糖尿病治療組體重與正常對照組比較明顯升高（P＜0.01），高于正常組體重的25%以上，根據(jù)肥胖的標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)達到了肥胖。第9周開始STZ注射（35mg／kg體重），72h后尾靜脈取血測血糖，血糖值＞16.7mmol／L，治療對照組的血糖和胰島素水平均明顯升高（P＜0.01）?？赡苡捎陂L達16周高脂攝食的過程，致體內(nèi)能量過剩，糖脂質(zhì)代謝紊亂，肥胖產(chǎn)生的基礎(chǔ)上STZ注射后，胰島素的敏感性下降，胰島素的分泌不足等即胰島素抵抗，胰島素效應(yīng)減低，胰島素介導(dǎo)的肌肉脂肪組織攝取葡萄糖能力降低，同時肝臟葡萄糖輸出增加，機體為了維持正常的血糖水平，代償性的胰島素分泌增加，引發(fā)了高胰島素血癥。當(dāng)β細(xì)胞分泌胰島素不能完全代償胰島素抵抗時，導(dǎo)致β細(xì)胞功能衰竭，胰島素分泌減少，血糖升高，最終發(fā)生了糖尿病。以上結(jié)果表明糖尿病造模的成功。

3.2 有氧運動對Ⅱ型糖尿病大鼠骨骼肌瘦素受體蛋白表達的影響 叢琳［9］等對Ⅱ型糖尿病運動組的大鼠進行12周的跑臺訓(xùn)練后，發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠骨骼肌、肝臟、胰腺等組織的瘦素受體蛋白含量和mRNA水平都顯著增加（P＜0.05），認(rèn)為運動通過對瘦素受體蛋白功能和基因水平的影響介導(dǎo)胰島素代謝和分泌作用的改善，是運動糾正糖尿病能量代謝失衡的機制之一。

實驗中各運動組進行8周自由游泳運動訓(xùn)練。糖尿病治療運動組骨骼肌瘦素受體蛋白表達顯著升高（P＜0.05），認(rèn)為運動可以通過上調(diào)骨骼肌瘦素受體蛋白表達，改善瘦素的敏感性，提高瘦素功能、改善瘦素抵抗。機體Leptin敏感性改善后，促進外周組織脂肪酸分解，降低脂質(zhì)在肝臟、骨骼肌、胰腺等外周組織中的聚集，增加肝臟、骨骼肌、胰腺等外周組織利用葡萄糖的能力，從而改善了胰島素抵抗。在一定程度上改善Ⅱ型糖尿病機體內(nèi)的糖脂代謝紊亂，對Ⅱ型糖尿病治療起到了有效作用。

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R965

A

1007－8517（2013）16－0043－03

2013.05.29）

高敬賢，女，碩士，從事病理生理學(xué)教學(xué)及科研工作。

白長喜，教授，博士生導(dǎo)師，從事蒙醫(yī)藥現(xiàn)代化開發(fā)與應(yīng)用的研究。E－mail：changbai2010＠yahoo.com.cn