韋永樸 將秋香

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006

小兒感冒顆粒微生物限度檢查方法的建立及驗(yàn)證

韋永樸 將秋香

廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006

目的：建立小兒感冒顆粒微生物限度檢查方法。方法：按《中國(guó)藥典》2010年版一部微生物限度檢查方法的要求進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：小兒感冒顆粒微生物限度檢查細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法采用常規(guī)法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%；控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法用大腸埃希菌采用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。結(jié)論：小兒感冒顆粒微生物限度檢查細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法可用常規(guī)法（1mL／皿）測(cè)定，控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法可用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）進(jìn)行檢查。

小兒感冒顆粒；微生物限度檢查

廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的小兒感冒顆粒，由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍(lán)根、地黃、地骨皮等經(jīng)煎煮、濃縮、提取揮發(fā)油等制劑而成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒作用。主要用于小兒風(fēng)熱感冒，癥見(jiàn)發(fā)熱重、頭脹痛、咳嗽痰黏、咽喉腫痛，流感等；該產(chǎn)品收載于中國(guó)藥典2010年版一部及國(guó)家基本藥物目錄。按《中國(guó)藥典》要求應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）的檢查，經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)，制定了該產(chǎn)品的微生物限度檢查的方法，并按《中國(guó)藥典》有關(guān)規(guī)定進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果符合其規(guī)定的要求，方法可行。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 樣品 小兒感冒顆粒（廣西金嗓子藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20100701、20100702、20100703）。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌種 大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC （B）63501］白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98 003］均由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、蛋白胨、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡萄糖培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基均由北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)；營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、4－甲基傘形酮葡萄糖對(duì)照培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基、乳糖膽鹽發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基均由中國(guó)藥品生物制品生產(chǎn)。

1.4 稀釋劑 pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液、0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液。

1.5 儀器及設(shè)施 電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微波爐、接種柜、高壓滅菌鍋、旋渦混合器、電熱干燥箱、環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域等。1.6 菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌第3代的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)18～24h，培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含50～100cfu的菌懸液；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含50～100cfu的菌懸液；接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7天，加入10mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1mL含孢子50～100cfu的孢子懸液。備用。

2 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法的建立

2.1 培養(yǎng)基適用性檢查

2.1.1 細(xì)菌用培養(yǎng)基適用性檢查 按規(guī)定程序新鮮配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。取7個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對(duì)照，然后傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基；另取7個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對(duì)照，然后傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。最后把平皿置33℃培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 細(xì)菌用培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.1.2 霉菌及酵母菌用培養(yǎng)基適用性檢查 按規(guī)定要求新鮮配制玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基，取5個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對(duì)照，然后傾注玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基；另取5個(gè)無(wú)菌平皿，分別接種白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接種1mL菌液（約50～100cfu），另一平皿作為空白對(duì)照，然后傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基。最后把平皿置25℃培養(yǎng)72h，計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)均大于對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均的70%，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部要求。

2.2 供試液制備 取供試品10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液至100mL，制成1：10的供試液。

表2 霉菌及酵母菌用培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.3 方法的建立 本品由廣藿香、菊花、連翹、大青葉、板藍(lán)根、地黃、地骨皮等經(jīng)煎煮、濃縮、提取揮發(fā)油等制劑而成，經(jīng)查閱相關(guān)資料及多年積累的經(jīng)驗(yàn)，確認(rèn)處方中所用的藥材抑菌作用不強(qiáng)。故確定細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法，選擇金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作為敏感菌株，對(duì)2.2供試液制備中的方法分別采用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）、培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）對(duì)試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組進(jìn)行多次的預(yù)試驗(yàn)，按公式計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 小兒感冒顆?；厥章暑A(yù)試驗(yàn)結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

2.4 方法的確定及驗(yàn)證 從預(yù)試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，金黃色葡萄球菌采用常規(guī)法回收率為98.1%，培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）回收率為101.9%，培養(yǎng)基稀釋法（0.2mL／皿）回收率為99.0%，確定細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法。白色念珠菌常規(guī)法回收率為94.6%，培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL／皿）回收率為94.6%；三種方法的菌回收率均大于70℅，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部微生物限度檢查的要求，故確定霉菌和酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法。

2.5 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)小兒感冒顆粒，細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿），分別加入藥典要求的五種驗(yàn)證菌株進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 小兒感冒顆粒回收率試驗(yàn)結(jié)果（菌落數(shù)cfu／皿）

批號(hào)菌種大腸埃希菌［CMCC（B）44102］金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］白色念珠菌［CMCC（F）98001］黑曲霉［CMCC（F）98003］平皿號(hào)12平均值12平均值12平均值12平均值12平均值試驗(yàn)組20100703 767374575355656464677571414543菌液組776270576360677068768480475652供試品對(duì)照組000000000000000回收率（%）105.791.794.188.882.7

3個(gè)批號(hào)樣品的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，小兒感冒顆粒細(xì)菌計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿）、霉菌和酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)法（1mL／皿）進(jìn)行檢驗(yàn)，五種規(guī)定試驗(yàn)菌的回收率均大于70%，符合《中國(guó)藥典》2010年版的規(guī)定，方法可行。

3 控制菌檢查方法的建立

3.1 大腸埃希菌

3.1.1 培養(yǎng)基適用性檢查 按要求新鮮配制曙紅亞甲藍(lán)對(duì)照瓊脂培養(yǎng)基及檢查用曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，然后分別注平板，冷卻后取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別涂布于上述平板；取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別加入4－甲基傘形酮葡萄糖對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用4－甲基傘形酮葡萄糖培養(yǎng)基，膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用膽鹽乳糖培養(yǎng)基，同時(shí)取0.1mL的金黃色葡萄糖球菌菌液（約50～100cfu）分別加入另兩瓶膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用膽鹽乳糖培養(yǎng)基。然后置33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 大腸埃希菌培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力符合《中國(guó)藥典》2010年版一部要求。

3.1.2 方法的建立 試驗(yàn)組：取1：10供試液10mL及10 ～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌）加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陽(yáng)性對(duì)照組：取10～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌）加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10mLL加入100mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基中。將上述各組置33℃培養(yǎng)18～24h。取各培養(yǎng)液0.2mL，分別接種至5mLMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5～24h時(shí)，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀察。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，再觀察結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6可知，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)。可按此供試液制備法按常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)，方法可行。

表6 大腸埃希菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 大腸菌群

3.2.1 培養(yǎng)基適用性檢查 按要求新鮮配制乳糖膽鹽發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，取0.1mL的大腸埃希菌菌液（約50～100cfu）分別加入乳糖膽鹽發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中，同時(shí)取0.1mL的金黃色葡萄糖球菌菌液（約50～100cfu）分別加入另兩瓶乳糖膽鹽對(duì)照培養(yǎng)基及檢查用乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。然后置33℃培養(yǎng)24h，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 大腸菌群培養(yǎng)基適用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示能力符合《中國(guó)藥典》2010年版一部要求。

3.2.2 方法的建立 試驗(yàn)組：取1：10供試液1mL及10 ～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌）加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。陽(yáng)性對(duì)照組：取10～100cfu試驗(yàn)菌（大腸埃希菌）加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照組：取0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液1mL加入10mL乳糖膽鹽培養(yǎng)基中。將上述各組置33℃培養(yǎng)18～24h觀察結(jié)果，然后分別劃線(xiàn)接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板35℃培養(yǎng)24h觀察結(jié)果，再?gòu)纳鲜銎桨迳咸羧?～5菌落分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表8。

由表8可知，試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組檢出大腸埃希菌，陰性對(duì)照組無(wú)菌生長(zhǎng)?？砂创斯┰囈褐苽浞ò闯Ｒ?guī)法進(jìn)行大腸菌群檢驗(yàn)，方法可行。

表8 大腸菌群的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)果與討論

按上述擬定的小兒感冒顆粒微生物限度檢查法，對(duì)三批樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，以考查該方法的可靠性及重現(xiàn)性，結(jié)果見(jiàn)表9。

由表9可知，小兒感冒顆粒微生物限度檢查：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法采用常規(guī)法（1mL／皿）、控制菌（大腸埃希菌、大腸菌群）檢查方法采用常規(guī)法（100mL／瓶、10mL／支）檢查，符合《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅩⅢC微生物限度檢查法有關(guān)規(guī)定，方法可行。但也存在一些問(wèn)題：（該產(chǎn)品含有生藥原粉，采用常規(guī)法檢查，菌落計(jì)數(shù)時(shí)有的菌落易與藥材細(xì)粉混淆，而加入TTC（氯化三苯四氮唑試液），使菌落與TTC作用后變紅，可解決這一問(wèn)題，但TTC對(duì)枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用。（因有藥材原粉，碰到樣品本底含菌量較多時(shí)，驗(yàn)證比較麻煩，需消除或減少樣品本身所含有的菌，才能方便檢驗(yàn)，有待于進(jìn)一步完善提高。中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

表9 小兒感冒顆粒微生物限度檢查結(jié)果

［3］馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2000.

Microbial limit test method development and validation for Xiao＇er Ganmao Granules

WEI Yong－pu，JIANG Qiu－xiang
Liuzhou food and drug control in Guangxi Zhuang Autonomous Region，Liuzhou 545006，China

ObjectiveTo establish microbial limit test method for Xiao＇er Ganmao Granules.Methodsaccording to microbial limit test method in Chinese Pharmacopoeia（2010 edition，VolumeⅠ）for verification test.Result Bacterial count、Mold count and Yeast count test by microbial limit test method of Xiao＇er Ganmao Granules could be verify by conventional method（1mL／vessel），the recovery rate（%）in trial group are not less than 70%；escherichia coli for check method of control bacterias（escherichia coli group、Coliform），adopt conventional method（100mL／flask、10mL／flask）to do the verification test，trial group、positive control group detected escherichia coli，negative control group have no bacterium.ConclusionBacterial count、Mold count and Yeast count test by microbial limit test method of Xiao＇er Ganmao Granules can adopt conventional method（1mL／vessel），check method of control bacterias（escherichia coli group、Coliform）can adopt conventional method（100mL／flask、10mL／flask）.

Xiao＇er Ganmao Granules；microbial limit test method

R963

A

1007－8517（2013）16－0030－04

2013.06.01）

韋永樸男，壯族，藥學(xué)中級(jí)，主要從事食品藥品微生物檢驗(yàn)工作。E－mail：weiyongpu2013＠sina.cn