亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        一種吡蟲(chóng)啉的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的研制

        2013-06-05 15:23:59馬寅生馮才偉賈芳芳
        山東畜牧獸醫(yī) 2013年5期
        關(guān)鍵詞:半抗原吡蟲(chóng)啉色譜法

        馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍

        (北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)

        一種吡蟲(chóng)啉的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的研制

        馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍

        (北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)

        本文利用酶聯(lián)免疫技術(shù)研制了一種快速檢測(cè)吡蟲(chóng)啉殘留的試劑盒,經(jīng)過(guò)測(cè)試,該試劑盒對(duì)蔬菜、水果樣本的檢測(cè)限為20μg/kg,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。本研究的吡蟲(chóng)啉ELISA檢測(cè)試劑盒能夠應(yīng)用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),使用簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

        吡蟲(chóng)啉 酶聯(lián)免疫試劑盒 蔬菜 水果 快速檢測(cè)

        吡蟲(chóng)啉(IMI)是煙堿類殺蟲(chóng)劑,具有廣譜、高效,害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性,對(duì)人、畜、植物和天敵安全等特點(diǎn),主要用于防治刺吸式口器害蟲(chóng)及其抗性品系[1,2]。目前,含IMI的農(nóng)藥產(chǎn)品已在120多個(gè)國(guó)家的140余種農(nóng)作物上登記使用,應(yīng)用范圍涉及糧食、經(jīng)濟(jì)、果樹(shù)、茶葉和蔬菜等[3]。然而,IMI的大量使用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重影響,同時(shí)畜禽因長(zhǎng)期食用含IMI殘留的植物,使其在體內(nèi)富集,最后經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體,危害人體健康。

        從文獻(xiàn)報(bào)道看,有關(guān)吡蟲(chóng)啉殘留的檢測(cè)方法主要集中于高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)4個(gè)方面。通過(guò)比較儀器法和快檢方法在我國(guó)實(shí)際檢測(cè)中所起到的作用,本研究著重建立一種檢測(cè)蔬菜、水果樣本中吡蟲(chóng)啉的酶聯(lián)免疫吸附法,該方法的準(zhǔn)確性高于一般的快速檢測(cè)方法,檢測(cè)程序及所需條件較儀器法更方便,尤其便于現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的檢測(cè),更適于中小企業(yè)對(duì)成本控制的需求。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白、碳酸鹽、戊二醛、卵清蛋白、硼氫化鈉等均購(gòu)自北京百欣試劑公司,蔬菜、水果購(gòu)自超市,酶標(biāo)儀購(gòu)自上海雷勃分析儀器有限公司,渦旋儀、均質(zhì)器購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 吡蟲(chóng)啉半抗原的制備 100ml二口瓶中加入吡蟲(chóng)啉0.25g,二甲基甲酰胺(DMF)1ml,水合氯化錫0.75g和乙醇10ml,氮?dú)馀趴?,控?5℃反應(yīng)40min,反應(yīng)液顯褐色,薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)完全。處理:降溫至室溫,加乙酸乙酯50ml,加飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)至弱堿性,大量鹽析出,乙酸乙酯40ml×2次萃取渾濁液,合并有機(jī)相,鹽水洗滌,無(wú)水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑,得固體產(chǎn)物0.22g。

        圖1 吡蟲(chóng)啉半抗原合成路線圖

        1.2.2 抗原的制備 (1)免疫原制備—吡蟲(chóng)啉半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原,溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取牛血清白蛋白(BSA)30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(CB)(pH 9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4g,用0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS) 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。(2)包被原制備—吡蟲(chóng)啉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取OVA 30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L CB(pH9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4h,用0.01mol/L PBS 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。

        1.2.3 酶標(biāo)板的制備 吡蟲(chóng)啉單克隆抗體及羊抗鼠抗抗體制備完成后,進(jìn)行酶標(biāo)板的制備。用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml,每孔加入100μl,37℃避光孵育2h,傾去孔中液體,用洗滌液洗滌2次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入200μl封閉液,37℃避光孵育2h,傾去孔內(nèi)液體拍干,干燥后用鋁膜真空密封保存。

        1.2.4 試劑盒靈敏度和檢測(cè)限試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值50%處所對(duì)應(yīng)的藥物濃度(IC50)來(lái)評(píng)價(jià)試劑盒的靈敏度。分別對(duì)20份蔬菜、水果空白樣品進(jìn)行檢測(cè),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測(cè)限。

        1.2.5 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo),重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式為:回收率(%)=實(shí)際測(cè)定值/理論值×100%,其中理論值為樣品的添加濃度;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%=SD/X×100%,其中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差,X為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。按100μg/kg、300μg/kg、500μg/kg三個(gè)濃度吡蟲(chóng)啉分別對(duì)蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定,每個(gè)樣品做4個(gè)平行,用三批不同試劑進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品的平均回收率及精密度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 半抗原合成鑒定結(jié)果

        用核磁共振氫譜測(cè)定制備好的吡蟲(chóng)啉半抗原,如圖2所示,4.7ppm左右的峰為咪唑啉環(huán)上的兩個(gè)亞甲基信號(hào)峰,5.0ppm左右的峰為芐基信號(hào)峰,7.2-8.7ppm為氨基與芳環(huán)混合信號(hào)峰,說(shuō)明目標(biāo)半抗原合成成功。

        圖2 吡蟲(chóng)啉半抗原核磁共振氫譜圖

        2.2 試劑盒靈敏度和檢測(cè)限

        按照常規(guī)方法測(cè)定試劑盒靈敏度,試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)為4μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為4~324μg/kg,IC50(50%抑制濃度)為12.9μg/kg;對(duì)20份樣品進(jìn)行檢測(cè),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測(cè)限,結(jié)果得該方法對(duì)樣本的檢測(cè)限為20μg/kg。見(jiàn)圖3。

        圖3 吡蟲(chóng)啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        2.3 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

        以100、300、500μg/kg三個(gè)濃度的吡蟲(chóng)啉分別對(duì)蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加,平均回收率在83.5%~117.9%之間;批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。見(jiàn)表1、2。

        表1 蔬菜精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) (μg/kg、%)

        表2 水果精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) (μg/kg、%)

        3 討論

        目前,高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)是檢測(cè)吡蟲(chóng)啉殘留的主要方法。Placke and Weber曾經(jīng)報(bào)道了運(yùn)用HPLCUVD研究了IMI在植物中的殘留量[4]。IshiiY等也采用HPLC-UVD檢測(cè)技術(shù)研究了IMI在部分作物和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)[5]。Fermandz Alba A R等用HPLC-DAD測(cè)定蔬菜中IMI殘留量[6]。Erenchun N R等還采用HPLC-PRAD測(cè)定了土壤中的殘留IMI及其主要降解物含量[7]。Fernadez Alba A R等應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)檢測(cè)蔬菜中IMI殘留量,得到了小于1.0 mg/kg的檢出限[8]。有關(guān)IMI殘留GC測(cè)定方法主要集中在GC-MS聯(lián)用技術(shù)上,如NavalonA.等運(yùn)用GC-MS測(cè)定蔬菜中IMI的殘留量,得到了1.25~25mg/kg的線性檢測(cè)范圍和2.5mg/kg的檢測(cè)限[9]。IMI殘留的電化學(xué)分析方法報(bào)道較少,且其線性檢測(cè)范圍,檢測(cè)限均不及色譜法。在IMI殘留的免疫檢測(cè)方法方面,Jae Koo Lee等報(bào)道了通過(guò)制備IMI-pAb,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)蘋(píng)果和水中的IMI殘留,其檢測(cè)限為5.0μg/L[10]。Zhixiong Li等報(bào)道了基于抗IMI多克隆抗體(IMI-pAb)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA,檢測(cè)限是30ng/ml[11]。國(guó)內(nèi),鄭尊濤等報(bào)道了IMI的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,最低檢測(cè)限為1.2μg/L,該研究的下一步計(jì)劃是研發(fā)試劑盒[12]。朱國(guó)念等在2005年制備了吡蟲(chóng)啉多克隆抗體,利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定其檢測(cè)限為1.1 μg/L[13]。本研究的吡蟲(chóng)啉ELISA快速檢測(cè)試劑盒比起高效液相色譜法、氣相色譜法以及電化學(xué)分析法更為簡(jiǎn)便;該試劑盒對(duì)蔬菜、水果樣本的檢測(cè)限為20μg/kg,雖然比起上述文獻(xiàn)中的同類方法較高,但是此類文獻(xiàn)并未開(kāi)發(fā)出試劑盒,實(shí)際應(yīng)用性有待加強(qiáng);同時(shí)該試劑盒的操作時(shí)間僅需1.5h,即具有更適宜現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

        目前,色譜法是公認(rèn)的藥物殘留檢測(cè)方法,但這類方法普遍存在著所需儀器昂貴、操作技術(shù)要求高、樣品前處理繁瑣和分析耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高、不適于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)等問(wèn)題。而藥物殘留免疫檢測(cè)技術(shù)在殘留樣本檢測(cè)過(guò)程中的復(fù)雜程度、速度、靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性、單位時(shí)間內(nèi)樣本分析容量、檢測(cè)成本等方面與儀器分析法的比較優(yōu)勢(shì)突出,幾乎克服了儀器分析法所表現(xiàn)出來(lái)的所有不足,近年來(lái)已經(jīng)在食品質(zhì)量安全檢測(cè)中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用,逐漸被人們認(rèn)可。

        今天,人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全呼聲日益提高,農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的有效檢測(cè)手段致關(guān)重要。國(guó)際上對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲(chóng)啉最大殘留量的規(guī)定日益嚴(yán)格,為更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易和保護(hù)人民的健康,開(kāi)發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中IMI的殘留快速檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。免疫學(xué)方法是當(dāng)前藥物殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。如何使殘留樣本前處理程序更加簡(jiǎn)單、靈敏度更高、成本更低廉,是擺在我們面前亟待解決的重要問(wèn)題。

        [1] 劇曉青. 吡蟲(chóng)啉在茶葉和土壤中的降解動(dòng)態(tài)研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2006: 15.

        [2] 李廣領(lǐng), 姜金慶, 陳錫嶺等. 吡蟲(chóng)啉殘留酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(12): 228-233.

        [3] 李廣領(lǐng). 吡蟲(chóng)啉殘留免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)研究[D]. 河南科技學(xué)院, 2010: 1.

        [4] Plack F J and Werber E. Method of determining imidacloprid residues in plant materials[J]. Pflanzenschutz Nachr Bayer, 1993, 469(2): 109-182.

        [5] Ishii Y, Kobor I, Araki Y, et al. HPLC determination of the new insecticide imidacloprid and its behavior in rice and cucumber[J]. J. Agric. Food Chem, 1994, 42: 2917-2921.

        [6] Fernbndez Alba A R, Valverde A, Aguer A, et al. S. Determination of imidacloprid in vegetables by high-performance liquid chromatography with diode-arry detection[J]. J. Chromatogr. A, 1996. 721:97-105.

        [7] Erenchun N R, Balugera Z G, Goicolea M A et al. Determination of imidacloprid and its major metabolite in soils by liquid chromatography with pulsed reductive amperometric detection[J]. J. Analytical Chimica Acta, 1997, 349(1-3): 199-206.

        [8] Fernandez Alba A R, Tejedor A, Aguera A et al. Determination of imidacloprid and benzimidazole residues in fruits and vegetables by liquid chromatography-mass spectrometry after ethyl acetate multiresidue extraction[J]. J. AOAC Int, 2000, 83(3): 748-755.

        [9] Navalon A, Gonzalez Casado A, Khattabi R et al. Determination of imidacloprid in vegetable samples by gas chromatography-mass spectrometry [J]. Analyst, 1997, 122 (6):579-581.

        [10] Jae Koo Lee, Ki Chang Ahn, Oee Suk Park, etal. Development of an ELISA for the Detection of the Residues of the Insecticide Imidacloprid in Agricultural and Environmental Samples[J]. J. Agric. Food Chem, 2001, 49, 2159-2167.

        [11] Zhixiong Li, Yingli Liu, Yuanming Sun, et al. Development of polyclonal antibody based enzyme linked immunosorbent assay for the analysis of the agricultural insecticide imidacloprid: food quality and safety[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 2007, 16 (S1): 102-105.

        [12] 鄭尊濤. 殺蟲(chóng)劑吡蟲(chóng)啉和氟蟲(chóng)腈的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2004: 42.

        [13] 朱國(guó)念, 桂文君, 鄭尊濤等. 吡蟲(chóng)啉人工抗原的合成與鑒定[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(3): 511-515.

        S859.83

        A

        1007-1733(2013)05-0006-03

        2013–04–15)

        猜你喜歡
        半抗原吡蟲(chóng)啉色譜法
        牛羊布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)的建立與應(yīng)用
        70%吡蟲(chóng)啉水分散粒劑劑的配方研制
        云南化工(2021年9期)2021-12-21 07:43:42
        噻蟲(chóng)嗪、吡蟲(chóng)啉灌根防治蘋(píng)果綿蚜及砧穗組合抗性試驗(yàn)
        高效液相色譜法測(cè)定水中阿特拉津
        反相高效液相色譜法測(cè)定食品中的甜蜜素
        10%吡蟲(chóng)啉可濕性粉劑在蠶種生產(chǎn)上的應(yīng)用報(bào)告
        2017年巴西進(jìn)口近8000t吡蟲(chóng)啉價(jià)格上漲感受明顯
        酶聯(lián)免疫吸附分析法應(yīng)用于戰(zhàn)場(chǎng)水環(huán)境TNT檢測(cè)的可行性研究
        天名精內(nèi)酯酮多克隆抗體的制備
        孔雀石綠單克隆抗體制備和酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立
        五月婷婷激情小说| 老熟女富婆激情刺激对白| 朝鲜女人大白屁股ass孕交 | 亚洲h在线播放在线观看h| 18无码粉嫩小泬无套在线观看| 日韩免费高清视频网站| 日本免费三片在线视频| 77777亚洲午夜久久多喷| 亚洲日本一区二区一本一道| 在线a免费观看| 亚洲伊人免费综合网站| 论理视频二区三区四区在线观看| 天堂а在线中文在线新版| 亚洲av无码男人的天堂在线| 精品在免费线中文字幕久久| 日本顶级片一区二区三区 | 好看的中文字幕中文在线| 91九色老熟女免费资源| 性无码免费一区二区三区在线| 人体内射精一区二区三区| 久久亚洲中文字幕精品一区四| 国产精品亚洲一区二区三区在线看| 国产办公室秘书无码精品99| 国内a∨免费播放| 亚洲性69影视| 一区二区精品天堂亚洲av| 中文字幕人妻在线中字| 亚洲国产精品久久久久秋霞影院| 久久免费精品国产72精品剧情| 一区二区日本免费观看| 免费a级毛片无码免费视频首页| a级毛片100部免费看| 国内久久婷婷精品人双人| 日本一区中文字幕在线播放| 国产成人综合久久久久久| 少妇人妻偷人精品免费视频| 日韩AV无码一区二区三不卡| 青青草在线免费观看在线| 美女高潮黄又色高清视频免费| 99爱这里只有精品| 亚洲大胆视频在线观看|