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        一種吡蟲啉的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制

        2013-06-05 15:23:59馬寅生馮才偉賈芳芳
        山東畜牧獸醫(yī) 2013年5期
        關(guān)鍵詞:半抗原吡蟲啉色譜法

        馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍

        (北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)

        一種吡蟲啉的酶聯(lián)免疫快速檢測試劑盒的研制

        馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍

        (北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)

        本文利用酶聯(lián)免疫技術(shù)研制了一種快速檢測吡蟲啉殘留的試劑盒,經(jīng)過測試,該試劑盒對蔬菜、水果樣本的檢測限為20μg/kg,批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。本研究的吡蟲啉ELISA檢測試劑盒能夠應(yīng)用于大量樣品的現(xiàn)場檢測,使用簡便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

        吡蟲啉 酶聯(lián)免疫試劑盒 蔬菜 水果 快速檢測

        吡蟲啉(IMI)是煙堿類殺蟲劑,具有廣譜、高效,害蟲不易產(chǎn)生抗性,對人、畜、植物和天敵安全等特點,主要用于防治刺吸式口器害蟲及其抗性品系[1,2]。目前,含IMI的農(nóng)藥產(chǎn)品已在120多個國家的140余種農(nóng)作物上登記使用,應(yīng)用范圍涉及糧食、經(jīng)濟、果樹、茶葉和蔬菜等[3]。然而,IMI的大量使用對環(huán)境造成了嚴(yán)重影響,同時畜禽因長期食用含IMI殘留的植物,使其在體內(nèi)富集,最后經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體,危害人體健康。

        從文獻(xiàn)報道看,有關(guān)吡蟲啉殘留的檢測方法主要集中于高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)4個方面。通過比較儀器法和快檢方法在我國實際檢測中所起到的作用,本研究著重建立一種檢測蔬菜、水果樣本中吡蟲啉的酶聯(lián)免疫吸附法,該方法的準(zhǔn)確性高于一般的快速檢測方法,檢測程序及所需條件較儀器法更方便,尤其便于現(xiàn)場大量樣本的檢測,更適于中小企業(yè)對成本控制的需求。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白、碳酸鹽、戊二醛、卵清蛋白、硼氫化鈉等均購自北京百欣試劑公司,蔬菜、水果購自超市,酶標(biāo)儀購自上海雷勃分析儀器有限公司,渦旋儀、均質(zhì)器購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 方法

        1.2.1 吡蟲啉半抗原的制備 100ml二口瓶中加入吡蟲啉0.25g,二甲基甲酰胺(DMF)1ml,水合氯化錫0.75g和乙醇10ml,氮氣排空,控溫65℃反應(yīng)40min,反應(yīng)液顯褐色,薄層色譜(TLC)檢測反應(yīng)完全。處理:降溫至室溫,加乙酸乙酯50ml,加飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)至弱堿性,大量鹽析出,乙酸乙酯40ml×2次萃取渾濁液,合并有機相,鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑,得固體產(chǎn)物0.22g。

        圖1 吡蟲啉半抗原合成路線圖

        1.2.2 抗原的制備 (1)免疫原制備—吡蟲啉半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原,溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取牛血清白蛋白(BSA)30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(CB)(pH 9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4g,用0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS) 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。(2)包被原制備—吡蟲啉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取OVA 30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L CB(pH9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4h,用0.01mol/L PBS 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。

        1.2.3 酶標(biāo)板的制備 吡蟲啉單克隆抗體及羊抗鼠抗抗體制備完成后,進(jìn)行酶標(biāo)板的制備。用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml,每孔加入100μl,37℃避光孵育2h,傾去孔中液體,用洗滌液洗滌2次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入200μl封閉液,37℃避光孵育2h,傾去孔內(nèi)液體拍干,干燥后用鋁膜真空密封保存。

        1.2.4 試劑盒靈敏度和檢測限試驗 以標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值50%處所對應(yīng)的藥物濃度(IC50)來評價試劑盒的靈敏度。分別對20份蔬菜、水果空白樣品進(jìn)行檢測,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測限。

        1.2.5 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗 以回收率作為準(zhǔn)確度評價指標(biāo),重復(fù)測定某一濃度樣品的檢測結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)作為精密度評價指標(biāo)。計算公式為:回收率(%)=實際測定值/理論值×100%,其中理論值為樣品的添加濃度;相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%=SD/X×100%,其中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差,X為測定數(shù)據(jù)的平均值。按100μg/kg、300μg/kg、500μg/kg三個濃度吡蟲啉分別對蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加回收測定,每個樣品做4個平行,用三批不同試劑進(jìn)行測定,計算樣品的平均回收率及精密度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 半抗原合成鑒定結(jié)果

        用核磁共振氫譜測定制備好的吡蟲啉半抗原,如圖2所示,4.7ppm左右的峰為咪唑啉環(huán)上的兩個亞甲基信號峰,5.0ppm左右的峰為芐基信號峰,7.2-8.7ppm為氨基與芳環(huán)混合信號峰,說明目標(biāo)半抗原合成成功。

        圖2 吡蟲啉半抗原核磁共振氫譜圖

        2.2 試劑盒靈敏度和檢測限

        按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度,試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點為4μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為4~324μg/kg,IC50(50%抑制濃度)為12.9μg/kg;對20份樣品進(jìn)行檢測,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測限,結(jié)果得該方法對樣本的檢測限為20μg/kg。見圖3。

        圖3 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        2.3 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗

        以100、300、500μg/kg三個濃度的吡蟲啉分別對蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加,平均回收率在83.5%~117.9%之間;批內(nèi)、批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。見表1、2。

        表1 蔬菜精密度及準(zhǔn)確度試驗 (μg/kg、%)

        表2 水果精密度及準(zhǔn)確度試驗 (μg/kg、%)

        3 討論

        目前,高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)是檢測吡蟲啉殘留的主要方法。Placke and Weber曾經(jīng)報道了運用HPLCUVD研究了IMI在植物中的殘留量[4]。IshiiY等也采用HPLC-UVD檢測技術(shù)研究了IMI在部分作物和土壤中的殘留動態(tài)[5]。Fermandz Alba A R等用HPLC-DAD測定蔬菜中IMI殘留量[6]。Erenchun N R等還采用HPLC-PRAD測定了土壤中的殘留IMI及其主要降解物含量[7]。Fernadez Alba A R等應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)檢測蔬菜中IMI殘留量,得到了小于1.0 mg/kg的檢出限[8]。有關(guān)IMI殘留GC測定方法主要集中在GC-MS聯(lián)用技術(shù)上,如NavalonA.等運用GC-MS測定蔬菜中IMI的殘留量,得到了1.25~25mg/kg的線性檢測范圍和2.5mg/kg的檢測限[9]。IMI殘留的電化學(xué)分析方法報道較少,且其線性檢測范圍,檢測限均不及色譜法。在IMI殘留的免疫檢測方法方面,Jae Koo Lee等報道了通過制備IMI-pAb,采用間接競爭ELISA檢測蘋果和水中的IMI殘留,其檢測限為5.0μg/L[10]。Zhixiong Li等報道了基于抗IMI多克隆抗體(IMI-pAb)的間接競爭ELISA,檢測限是30ng/ml[11]。國內(nèi),鄭尊濤等報道了IMI的間接競爭ELISA檢測方法,最低檢測限為1.2μg/L,該研究的下一步計劃是研發(fā)試劑盒[12]。朱國念等在2005年制備了吡蟲啉多克隆抗體,利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測定其檢測限為1.1 μg/L[13]。本研究的吡蟲啉ELISA快速檢測試劑盒比起高效液相色譜法、氣相色譜法以及電化學(xué)分析法更為簡便;該試劑盒對蔬菜、水果樣本的檢測限為20μg/kg,雖然比起上述文獻(xiàn)中的同類方法較高,但是此類文獻(xiàn)并未開發(fā)出試劑盒,實際應(yīng)用性有待加強;同時該試劑盒的操作時間僅需1.5h,即具有更適宜現(xiàn)場快速檢測的優(yōu)點。

        目前,色譜法是公認(rèn)的藥物殘留檢測方法,但這類方法普遍存在著所需儀器昂貴、操作技術(shù)要求高、樣品前處理繁瑣和分析耗時長、檢測成本高、不適于現(xiàn)場實時檢測等問題。而藥物殘留免疫檢測技術(shù)在殘留樣本檢測過程中的復(fù)雜程度、速度、靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性、單位時間內(nèi)樣本分析容量、檢測成本等方面與儀器分析法的比較優(yōu)勢突出,幾乎克服了儀器分析法所表現(xiàn)出來的所有不足,近年來已經(jīng)在食品質(zhì)量安全檢測中得到了越來越廣泛的應(yīng)用,逐漸被人們認(rèn)可。

        今天,人們對農(nóng)產(chǎn)品安全呼聲日益提高,農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的有效檢測手段致關(guān)重要。國際上對農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉最大殘留量的規(guī)定日益嚴(yán)格,為更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易和保護人民的健康,開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中IMI的殘留快速檢測技術(shù)勢在必行。免疫學(xué)方法是當(dāng)前藥物殘留檢測的研究熱點。如何使殘留樣本前處理程序更加簡單、靈敏度更高、成本更低廉,是擺在我們面前亟待解決的重要問題。

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        1007-1733(2013)05-0006-03

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