趙玉梅 （青海省海南州獸醫(yī)站 813000） 范玉霞 （青海省牧科院 西寧 810000）

試驗(yàn)研究

肉雞死胚中沙門氏菌的分離及血清學(xué)鑒定

趙玉梅 （青海省海南州獸醫(yī)站 813000） 范玉霞 （青海省牧科院 西寧 810000）

對大通縣某雞場孵化21d的42枚死亡雞胚無菌采集心、肝、脾、肺等臟器，進(jìn)行常規(guī)的細(xì)菌分離與培養(yǎng)，分離出9株沙門氏菌，陽性率為21.43%，并對分離到的菌株進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定、血清型鑒定和動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果顯示，此批死雞胚中沙門氏菌的帶菌率較高，應(yīng)該引起有關(guān)部門的重視。

沙門氏菌 死胚 分離 血清學(xué) 鑒定

沙門氏菌是一種重要的革蘭氏陰性，細(xì)胞內(nèi)寄生的，形態(tài)、生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似的人畜共患的腸道病原菌，其型別繁多，定型復(fù)雜[1]。目前，有關(guān)沙門氏菌的分類已有改進(jìn)，依據(jù)新的分類方法，沙門氏菌可分為兩個(gè)種，即S.enterica 和S.bongori[2]，迄今為止全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了2523個(gè)血清型，而我國發(fā)現(xiàn)的就有216種[3，4]，而且還有新的血清型在不斷地被發(fā)現(xiàn)。沙門氏菌在自然界中分布十分廣泛，不但能引起家畜家禽及其他動(dòng)物發(fā)生急性、慢性或隱性感染，而且在爬行冷血?jiǎng)游镏械膸ЬF(xiàn)象也很普遍。除此之外，它還能通過污染食物導(dǎo)致人的食物中毒，對人類身體健康構(gòu)成潛在的威脅[5，6，7]。中國是世界上養(yǎng)雞最多的國家，多年以來，禽病一直是困擾我國養(yǎng)禽業(yè)的關(guān)鍵問題之一。目前我國禽病約有80余種，其中傳染病占75.21%，非傳染性疾病占24.79%[8],據(jù)估計(jì)我國家禽死亡損失年均約百億元，雞沙門氏菌病是由沙門氏菌屬細(xì)菌引起的一種常見的腸道傳染病。嚴(yán)重影響種蛋的孵化率、雛雞存活率和雞產(chǎn)蛋率，對畜禽業(yè)的發(fā)展影響很大[9]，它是造成我國家禽成活率不高的一個(gè)主要原因。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已建立了多種快速檢測沙門氏菌的方法，有ELISA、氣相色普、生物發(fā)光技術(shù)、放射免疫測定法等高新技術(shù)及API、R-B、E-15等簡易生化診斷技術(shù)[10,11,12]。這些方法雖能準(zhǔn)確、快速地檢測出沙門氏菌，但存在著耗時(shí)，耗力，檢測成本高，且需要價(jià)格昂貴的儀器設(shè)備等特點(diǎn)，不宜于基層的推廣應(yīng)用。相比之下，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)、生化反應(yīng)和血清學(xué)鑒定等常規(guī)方法，雖然也存在著費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，但常規(guī)的病原分離操作步驟比較簡單、易行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較可靠。

2009年3月在大通縣某雞場孵化21d的死胚數(shù)量增加，經(jīng)剖檢后可見卵黃囊發(fā)炎，卵黃均吸收不良，大多為黃綠色干酪樣物質(zhì)，肝臟腫大且有充血、淤血，十二指腸內(nèi)有干酪樣物質(zhì)，為了初步摸清沙門氏菌在該場死胚中的感染情況，對采集的42死胚進(jìn)行了常規(guī)的細(xì)菌分離、培養(yǎng)及血清學(xué)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無菌采取大通縣某雞場肉雞死胚中的心、肝、脾、肺等臟器，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、S.S瓊脂平板、普通營養(yǎng)肉湯及葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、MR、H2S、V-P、枸櫞酸、尿素酶、靛基質(zhì)、硝酸鹽、三糖鐵(TSI)等各種生化培養(yǎng)基。均由青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系傳染病實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 沙門氏菌診斷血清 沙門氏菌的163種診斷血清(批號：810003，購于衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所)。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明系小白鼠4只，15～16g/只(均購自于青海省地方研究所）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集及死雞胚的剖檢 將送檢的死亡種蛋編號，分別用75%的酒精將種蛋外殼消毒后，打破蛋殼，取出胚胎，置于滅菌的平皿中，用酒精棉球涂擦胚胎胸腹部，再分別用滅菌的剪、鑷剪開胸腹腔，依次采取心、肝、脾、肺等臟器，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。最后再進(jìn)行死胚病變的觀察。

1.2.2 細(xì)菌的分離、純化及染色鏡檢 將病料接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18～24h后用滅菌接種環(huán)勾取肉湯培養(yǎng)物分別接種于普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和S.S瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察菌落形態(tài)，勾取1/3疑似菌落涂片，染色鏡檢，勾取G-菌落，在S.S瓊脂平板上進(jìn)行數(shù)次純化培養(yǎng)，而后將分純的細(xì)菌接種到普通斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h后，置4℃冰箱備用。

1.2.3 生化鑒定 將分純的9株疑似沙門氏菌菌株分別接種于葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、MR、H2S、V-P、枸櫞酸、尿素酶、靛基質(zhì)、硝酸鹽、三糖鐵(TSI)等各種生化培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～48h后，觀察其結(jié)果。

1.2.4 血清型鑒定 將分純的9株疑似沙門氏菌分別用沙門氏菌A～F多價(jià)血清凝集，再用因子血清分型，操作步驟按沙門氏菌診斷血清操作說明書進(jìn)行。

1.2.5 動(dòng)物試驗(yàn) 分別勾取疑似沙門氏菌的菌株接種于4塊普通營養(yǎng)瓊脂平板上，于37℃培養(yǎng)18～24h后，用滅菌的生理鹽水將其無菌洗下，制成菌懸液，用麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，選取8×108個(gè)活菌/ml濃度，分別腹下注射4只小白鼠，0.2ml/只，同時(shí)用滅菌的生理鹽水腹下注射2只小白鼠，作對照試驗(yàn)，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 死胚病變

死雞胚剖檢后可見卵黃囊發(fā)炎，卵黃均吸收不良，大多數(shù)有黃綠色干酪樣物質(zhì)，肝臟腫大且有充血、淤血，十二指腸內(nèi)有干酪樣物質(zhì)。

2.2 菌落形態(tài)及培養(yǎng)特性

9株分離菌在麥康凱瓊脂平板上不生長；在S.S瓊脂平板上形成無色或灰白色、圓形，半透明、表面光滑、濕潤、隆起、邊緣整齊的菌落；在普通瓊脂平板上為圓形、隆起、光滑、濕潤、無色、半透明、似露珠大小的菌落；普通營養(yǎng)肉湯均勻混濁。

2.3 生化鑒定結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果

通過血清學(xué)鑒定，分離出5株甲型副傷寒沙門氏菌，3株雞傷寒沙門氏菌，1株雞白痢沙門氏菌。

表2 血清學(xué)鑒定結(jié)果 (%)

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組的4只小白鼠在24～36 h后內(nèi)全部死亡，接種生理鹽水的2只對照組小白鼠飼喂7d后仍健活。剖檢死鼠可見到胸腹腔中有大量積液，肝臟腫大，邊緣淤血，腸管出血，有的腸管部分淤血，脾臟出血，左右心室有部分淤血現(xiàn)象。無菌采取死亡小鼠的肝、脾等臟器觸片、染色鏡檢，可觀察到有革蘭氏陰性桿菌，同時(shí)進(jìn)行細(xì)菌的分離，分離到了與上述一致的革蘭氏陰性小桿菌。

3 討論

（1）從大通縣某雞場孵化的42枚死雞胚中分離出9株細(xì)菌，所檢死胚中沙門氏菌的帶菌率是21.43%，結(jié)合死亡小白鼠的病理變化，認(rèn)為細(xì)菌性因素很可能是造成雞場孵化率降低的一個(gè)主要原因[13]。（2）通過血清學(xué)鑒定，分離出5株甲型副傷寒沙門氏菌，陽性率11.91%，3株雞傷寒沙門氏菌，陽性率7.14%，1株雞白痢沙門氏菌，陽性率2.38%。從結(jié)果來看，其中雞傷寒沙門氏菌占分離菌株的33.33%；雞白痢沙門氏菌占分離菌株的11.11%；甲型副傷寒沙門氏菌占分離菌株的55.56%，甲型副傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢菌。（3）早在50年代中后期，Duguid等認(rèn)為細(xì)菌的菌毛與致病性有關(guān)，菌毛可以與宿主細(xì)胞特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌與宿主細(xì)胞的粘連，構(gòu)成細(xì)菌感染的開始。沙門氏菌常存在于雞只的卵巢等生殖道和腸內(nèi)容物中，可在種卵在形成過程中，由病菌經(jīng)輸卵管進(jìn)入蛋內(nèi)或在通過泄殖腔及孵化過程中蛋殼表面遭到污染[14]。一般帶菌種雞所產(chǎn)種蛋的帶菌率可達(dá)20%～30%，不僅孵化率低，并有死雛和病雛。加之孵化場消毒工作不徹底等因素的影響，病原菌可污染孵化器、出雛器和育雛室，造成水平傳播，直接和間接損失巨大。如果污染孵化器和出雛器，則孵化出來的幼雛就會被感染。因此種雞場的孵化室、育雛室等所有器具要經(jīng)常清洗消毒，育雛早期用藥應(yīng)選用高敏藥物，并且要更換使用。加強(qiáng)對雛雞、飼料和飲水的檢查，雞舍內(nèi)的灰塵和病雞，定期進(jìn)行沙門氏菌監(jiān)測檢查和凈化，確保衛(wèi)生管理的效果和雞場、雞群的清凈度[15,16]。減少沙門氏菌的感染及發(fā)病機(jī)率，從而提高孵化率。（4）沙門氏菌既可以水平傳播，也可垂直傳播。污染面積甚大，常致雞終生感染，雞沙門氏菌病包括雞白痢，雞傷寒，雞副傷寒三個(gè)疫病，雞白痢是由雞白痢沙門氏菌引起，雞傷寒是由雞傷寒沙門氏菌引起，雞副傷寒是由多種沙門氏菌引起[17,18,19]。雞副傷寒可導(dǎo)致各種幼齡禽高發(fā)病率和高死亡率，感染了雞副傷寒沙門氏菌的雞群，其環(huán)境污染嚴(yán)重，應(yīng)予及時(shí)進(jìn)行消毒。其中人和各種動(dòng)物對引起禽副傷寒的沙門氏菌均具有易感性，而來源于禽副傷寒的禽類產(chǎn)品常是導(dǎo)致人類沙門氏菌感染和食物中毒的重要原因之一[20]，經(jīng)常在歐美、日本等導(dǎo)致嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題，也是我國禽肉和蛋制品難以出口的主要原因之一。另外，由于養(yǎng)禽生產(chǎn)單位為控制或凈化禽沙門氏菌病，經(jīng)常在飼料或飲水中加入各種抗生素，常導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。1985年在歐美、1989年在日本，由沙門氏菌引起的食物中毒急劇增加。為此，1989年3月在瑞士召開了“關(guān)于防止雞與蛋沙門氏菌污染”的世界衛(wèi)生組織緊急會議，討論食物中毒的原因和今后的預(yù)防對策。（5）在食品蛋所攜帶的微生物中沙門氏菌對人體最有害，是致病菌[21]。我國現(xiàn)行鮮蛋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，沒有考慮雞蛋所帶的微生物數(shù)量，美國食品蛋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，帶有沙門氏菌的食品蛋視為不合格產(chǎn)品，不能食用。所有食品蛋必須通過清洗消毒、保鮮處理，才能上市銷售。也只有這樣，廣大消費(fèi)者才能獲得安全、衛(wèi)生的食品蛋。此外孵化場將未孵化的種蛋以毛蛋的形式出售，而一些消費(fèi)者又有食用毛蛋的習(xí)慣，無形當(dāng)中增加了人類感染沙門氏菌的潛在危險(xiǎn)性。（6）目前引起沙門氏菌感染的主要原因可能有以下幾種：大多數(shù)中小型雞場都是在原有家庭分散小群飼養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，忽視了大群飼養(yǎng)后疫病防治工作的重要性；孵化場選蛋和種蛋消毒不嚴(yán)；雞胚感染沙門氏菌比例較高，導(dǎo)致大量死亡，一部分帶有沙門氏菌的雞出殼后陸續(xù)發(fā)病，死亡增加；盲目引進(jìn)種雞；飼料配合不當(dāng)；潛在疾病控制不力，致使沙門氏菌感染率增高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。我國的禽病防治水平與世界發(fā)達(dá)國家相比還存在著差距，在我國加入WTO的今天，我國的禽病防治只有盡快地與國際接軌，建立有效的運(yùn)行機(jī)制以符合我國實(shí)際的防治策略與措施，才能真正使我國養(yǎng)禽業(yè)走向世界。

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