張俊明 郭 晟 方 鋁 余 華 鐘小群 張愛(ài)華

（江西省藥物研究所，南昌，330029）

銀馬抗病毒顆?？咕?、抑制遲發(fā)性超敏免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

張俊明 郭 晟 方 鋁 余 華 鐘小群 張愛(ài)華

（江西省藥物研究所，南昌，330029）

目的：研究銀馬抗病毒顆粒抑菌及對(duì)遲發(fā)性免疫反應(yīng)的作用。方法：通過(guò)體外試管倍比稀釋法及體內(nèi)抗菌，觀察銀馬抗病毒顆粒的抗菌作用；通過(guò)二硝基氟苯對(duì)小鼠致敏試驗(yàn)，觀察銀馬抗病毒顆粒對(duì)小鼠的遲發(fā)性免疫反應(yīng)的作用。結(jié)果：銀馬抗病毒顆粒藥物濃度為0.125 g·mL-1時(shí)，在體外對(duì)金黃色葡萄菌、乙型溶血性鏈球菌、甲型鏈球菌、綠膿桿菌及肺炎雙球菌具有抑菌作用；銀馬抗病毒顆粒能降低致病菌對(duì)小鼠的死亡率；銀馬抗病毒顆粒具有抑制小鼠遲發(fā)性免疫反應(yīng)的作用。結(jié)論：銀馬抗病毒顆粒具有體外、體內(nèi)抑菌的作用，具有抑制遲發(fā)性超敏反應(yīng)的作用。

銀馬抗病毒顆粒；抗菌；遲發(fā)性免疫反應(yīng)

銀馬抗病毒顆粒處方來(lái)源于清.吳瑭（鞠通）所著 《溫病條辨》中銀翹馬勃散方，采用傳統(tǒng)的溫水浸出工藝，利用現(xiàn)代化的β-環(huán)糊精包埋技術(shù)和流化床制備技術(shù)精制而成。由連翹、牛蒡子、金銀花、射干、馬勃及蘆根6味藥組成，具有清熱解毒、泄肺利咽的作用，主要用于濕溫、濕熱郁于上焦，喉阻咽痛、急性扁桃腺炎的治療，現(xiàn)將有關(guān)體外抑菌及遲發(fā)性免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 藥材 銀馬抗病毒顆粒，江西省藥物研究所天然藥物室提供，批號(hào)：010915；雙黃連口服液，黑龍江完達(dá)山制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：20010303；頭孢拉啶，上海五洲藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：010647。

1.2 動(dòng)物 昆明種清潔級(jí)小鼠，動(dòng)物合格證號(hào)：2004001105296，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)用菌 金黃色葡萄球菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌，均購(gòu)中國(guó)生物制品檢定所，甲型鏈球菌購(gòu)自江西省食品藥品檢測(cè)中心，臨床分離致病菌：金黃色葡萄球菌，由江西醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供，江西醫(yī)學(xué)院微生物教研室鑒定。

1.4 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，批號(hào)：20030112，北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；營(yíng)養(yǎng)肉湯+兔血培養(yǎng)基，自制。

1.5 儀器 FA-NJA-N電子天平，上海民橋精密儀器有限公司生產(chǎn)；LRH系列生化培養(yǎng)箱，上海-恒溫科學(xué)儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海中安醫(yī)療器械廠。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 銀馬抗病毒顆粒體外抑菌試驗(yàn)［1］采用試管倍比稀釋法進(jìn)行，即采用液體培養(yǎng)基將樣品倍比稀釋。操作方法如下。培養(yǎng)基的制備：選擇適合試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基及營(yíng)養(yǎng)肉湯+兔血培養(yǎng)基。菌液的制備：分別從新鮮的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、乙型溶血型鏈球菌、肺炎雙球菌、甲型鏈球菌的菌種斜面沾取少量菌苔，分別接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基跟營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基+兔血培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后作為原菌液，用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取適宜的濃度0.1 mL測(cè)定活菌數(shù)。藥液的制備：將銀馬抗病毒顆粒用滅菌生理鹽水稀釋成2 g· mL-1最高濃度作為供試液。抑菌試驗(yàn)：準(zhǔn)備6支裝有1 mL體積培養(yǎng)基的試管，于第1管中加入同體積的藥液1mL，混合后吸取1mL加入第2管中，同法稀釋至第5管，從第5管中取出1 mL于一滅菌空試管中作為空白對(duì)照即為第6管，不加試驗(yàn)菌以便觀察供試液是否被污染。藥液的濃度為2 g·mL-1，那么1～5管的濃度則為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g·mL-1。第7管為陽(yáng)性對(duì)照管。取105稀釋級(jí)菌液0.1mL于各抑菌試管中，搖勻，將各試驗(yàn)管置于37℃培養(yǎng)24 h，然后觀察結(jié)果。

經(jīng)培養(yǎng)后的試驗(yàn)管呈現(xiàn)澄明，搖勻后仍澄明者，認(rèn)為該管無(wú)菌生長(zhǎng)，若培養(yǎng)管呈現(xiàn)混濁狀態(tài)，表明有菌生長(zhǎng)。從無(wú)菌生長(zhǎng)的各管中找出最低藥物濃度的試驗(yàn)管，該管的藥物濃度即為最低抑菌濃度。

2.1.2 銀馬抗病毒顆粒體內(nèi)抑菌試驗(yàn)［2］菌液稀釋：將金黃色葡萄球菌5.6×1013CFU·mL-1的原菌液用生理鹽水以10倍順序稀釋成為5.6×1012CFU· mL-1、5.6×1011CFU·mL-1、5.6×1010CFU·mL-1的菌液。

金黃色葡萄菌最小致死量（minimum lethal dose，MLD）測(cè)定：取18～22 g昆明種健康小鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組，每組10只，每組分別腹腔注射已稀釋的菌液觀察7 d內(nèi)動(dòng)物死亡數(shù)，測(cè)出金黃色葡萄球菌株90%最小致死量為5.6×1012CFU·mL-1。再取昆明種健康小鼠100只，雌雄各半，隨機(jī)分成對(duì)照組、銀馬抗病毒顆粒9.1、18.2、36.4 g·kg-1及陽(yáng)性對(duì)照頭孢拉啶0.3 g·kg-1，共5組，每組20只，各組均連灌胃7 d，先給藥4 d，第4 d給藥后1 h，每只小鼠均腹腔注射金黃色葡萄球菌0.5 mL／只，其濃度為5.6× 1012CFU·mL-1，于注射菌液24 h后再繼續(xù)給藥3 d，并觀察7 d內(nèi)小鼠死亡數(shù)，并與對(duì)照組比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2.1.3 銀馬抗病毒顆粒對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響［3］取昆明種健康小鼠60只，體重（20±2）g，隨機(jī)分為6組，分別為對(duì)照組、模型組、銀馬抗病毒顆粒9.1、18.2、36.4 g·kg-1及陽(yáng)性對(duì)照藥雙黃連6.0 mL ·kg-1，每組10只。各組均每天灌胃給予相應(yīng)的藥物1次，0.6 mL／20 g，連續(xù)10 d，對(duì)照組與模型組則給等量水，用藥第4 d，以脫毛劑在小鼠腹部脫毛處理，次日用1%二硝基氟苯（用1∶1丙酮麻油配制）在脫毛處致敏，每鼠25μL，涂均勻，24 h后再用同法加強(qiáng)致敏1次，致敏第4天用1%二硝基氟苯10μL，均勻涂抹左耳進(jìn)行攻擊，第2天處死小鼠，剪下左右雙耳，用9 mm打孔器在雙耳相應(yīng)部位各打一耳片，稱重，求出左右耳片重量之差進(jìn)行組間t檢驗(yàn)比較。

2.2 結(jié)果

2.2.1 銀馬抗病毒顆粒體外抑菌試驗(yàn) 銀馬抗病毒顆粒對(duì)所試菌種均有不同程度的抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、甲型鏈球菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.125 g·mL-1。對(duì)綠膿桿菌、肺炎雙球菌的最小抑菌濃度（MIC）為0.25 g·mL-1，見(jiàn)表1。

表1 銀馬抗病毒顆粒的最小抑菌濃度

2.2.2 銀馬抗病毒顆粒體內(nèi)抑菌試驗(yàn) 銀馬抗病毒顆粒18.2 g·kg-1與頭孢拉啶0.30 g·kg-1對(duì)金黃色葡萄球菌的臨床致病菌有較強(qiáng)的保護(hù)作用，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 銀馬抗病毒顆粒體內(nèi)抑菌試驗(yàn)（例數(shù)＝20）

2.2.3 銀馬抗病毒顆粒對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響［4］銀馬抗病毒顆粒18.2 kg-1與36.4 kg-1與雙黃連6.0 mL·kg-1能抑制小鼠耳腫脹，與模型組比較具有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01），見(jiàn)表3。

表3 銀馬抗病毒顆粒對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響（s，例數(shù)＝10）

表3 銀馬抗病毒顆粒對(duì)小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)的影響（s，例數(shù)＝10）

注：與正常組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量（kg-1） 兩耳重量差值（mg ）1.3±1.16模型組 ／ 8.4±4.22△銀馬抗病毒顆粒 9.1 7.1±2.38銀馬抗病毒顆粒 18.2 4.7±3.33*銀馬抗病毒顆粒 36.4 3.3±2.58**雙黃連 6.0mL·kg-1 4.6±3.20正常組 ／*

3 討論

銀馬抗病毒顆粒是將銀翹馬勃散方通過(guò)現(xiàn)代工藝精制成，具有清熱解毒、泄肺利咽的作用，主要用于濕溫、濕熱郁于上焦，喉阻咽痛、急性扁桃體炎的治療，方中多味藥均具有抗炎的作用，金銀花具有抗內(nèi)毒素、解熱及抗炎的作用［4-5］，連翹揮發(fā)油在體外對(duì)多種菌具有抑制作用［6-7］，牛蒡子提取物具有鎮(zhèn)痛抗炎作用［8］，均具有抗炎、抑菌的作用，另金銀花、牛蒡子等具有免疫調(diào)節(jié)作用［9-11］。

在抗菌試驗(yàn)中，銀馬抗病毒顆粒在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、甲型鏈球菌、綠膿桿菌及肺炎球菌均具有抑菌作用，試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)不同細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC）在0.125～0.25 g·mL-1之間，銀馬抗病毒顆粒對(duì)金黃葡萄球菌致病的小鼠具有明顯的保護(hù)作用，是致病小鼠死亡率均較對(duì)照組降低，說(shuō)明銀馬抗病毒顆粒在體外體內(nèi)均具有一定的抗菌作用，為該藥物的抗菌作用提供藥理依據(jù)。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)［12-15］是由T細(xì)胞介導(dǎo)的，系由抗原進(jìn)入機(jī)體使T細(xì)胞致敏，當(dāng)再次接觸抗原時(shí)，致敏T細(xì)胞分化增殖，釋放各種淋巴因子及直接殺傷靶細(xì)胞，約24 h后，出現(xiàn)以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的局部炎癥反應(yīng)。試驗(yàn)中銀馬抗病毒顆粒具有明顯抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用，抑制作用隨劑量增加越明顯，這對(duì)治療急性扁桃體過(guò)程中變態(tài)反應(yīng)提供藥理依據(jù)。

［1］童國(guó)忠，馬劍茵，石亞素，等.舟山野菊花序不同萃取物抑菌活性的研究［J］.浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，29（6）：562-564.

［2］徐萍，趙磊.清利通淋湯體外和體內(nèi)抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33（11）：1063-1065.

［3］邱果，包旭，李穎，等.杜仲葉醇提取物對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2008，24（4）：41-42.

［4］雷玲，李興平，白筱璐，等.金銀花抗內(nèi)毒素、解熱、抗炎作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（1）：115-117.

［5］龐瑞.金銀花有效成分的藥理學(xué)研究進(jìn)展［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34（3）：77-79.

［6］肖會(huì)敏.何悅.王四旺，等.連翹揮發(fā)油體外抑菌實(shí)驗(yàn)研究［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2011，23（15）：99-100.

［7］馬雪梅，馬文兵.連翹提取物的抑菌活性研究［J］.光明中醫(yī)，2012，27（8）：1529-1531.

［8］黃少華，黃禮德，劉勝利，等.牛蒡子提取物鎮(zhèn)痛抗炎作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］，右江民族醫(yī)學(xué)院院報(bào)，2012，34（1）：7-9.

［9］崔曉燕.金銀花提取物的抗炎免疫作用研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2011，20（23）：8-9.

［10］鮑雯雯，歷淑芬，叢曉東.牛蒡子藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2011，3：45-46.

［11］王潞，趙烽，劉珂，等.牛蒡子苷及牛蒡子苷元的藥理作用研究進(jìn)展［J］.中草藥，2008，39（3）：467-470.

［12］劉晉華，李玉萍，尤光普.青黛克銀丸抗過(guò)敏作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥科技，2011，18（6）：478-479.

［13］李覃，陳虹，白淑芳，等.青蒿琥酯對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（5）：843 -846.

［14］洪敏，鄭劼，匡燁，等.黃芪甲苷抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（6）：442-444，后插4-5.

［15］李莉，陳秋閣，王紅梅，等.水紅花子對(duì)小鼠免疫功能及遲發(fā)型超敏反應(yīng)的抑制作用［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，37（4）：125-127.

（2012-12-17收稿）

Experim ental Study on Antibacterial Effect and Inhibiting Delayed Type Hypersensitivity Function of Yinm a Antiviral G ranule

Zhang Junming，Guo Sheng，F(xiàn)ang Lv，Yu Hua，Zhong Xiaoqun，Zhang Aihua
（Jiang Xi Institute of Mater Medica，Nanchang 330029，China）

Objective：To study the antibacterial effect and function of inhibiting delayed type hypersensitivity of Yinma Antiviral Granule.M ethods：Themultiple proportion dilutionmethod in vitro tubewas used to observe the antibacterial effect of Yinma Antiviral Granule.Sensitized experiment of initrofluorobenzene onmice was conducted to observe the function of Yinma Antiviral Granule on delayed type hypersensitivity.Results：Yinma Antiviral Granule in concentration of0.125 g？mL-1 had antibacterial effect in vitro on staphylococcus bacteria，hemolytic streptococcus，group a streptococcus，pseudomonas aeruginosa and pneumococci；Yinma Antiviral Granule reduced micemortality effected by pathogenic bacteria；Yinma Antiviral Granule inhibited delayed type hypersensitivity on mice.Conclusion：Yinma Antiviral Granule has internal and external antibacterial effect and it could inhibit delayed type hypersensitivity function.

Yinma Antiviral Granule；Antibacterial；Delayed type hypersensitivity function

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.07.028