趙雪松 陳志剛 徐枝芳 高 芳

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京，100078）

早期使用三七總皂苷對大鼠腦出血炎性反應(yīng)的影響

趙雪松 陳志剛 徐枝芳 高 芳

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京，100078）

目的：早期使用三七總皂苷對腦出血大鼠（Intracerebral Hemorrhage，ICH）腦組織病理形態(tài)和炎性反應(yīng)遞質(zhì)細(xì)胞間黏附分子-1（Intercellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）的影響。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和三七總皂苷組，采用膠原酶注射尾狀核法制作腦出血模型，觀察腦組織病理形態(tài)變化；雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附實驗（Avidinbiotincomplex-ELISA，ABC-ELISA）觀察ICH大鼠血清炎性反應(yīng)遞質(zhì)ICAM-1和TNF -α的變化。結(jié)果：HE染色觀察到炎性細(xì)胞浸潤，也證實了腦出血急性期炎性反應(yīng)反應(yīng)較劇烈，三七總皂苷顯著減輕周圍腦組織水腫和神經(jīng)纖維排列紊亂現(xiàn)象；造模7 d時，模型組血清中的ICAM-1和TNF-α含量增加，三七總皂苷用藥7 d可下調(diào)ICAM-1（P＜0.05）和TNF-α。結(jié)論：三七總皂苷對腦出血后腦組織病理形態(tài)恢復(fù)正常具有促進(jìn)作用，抑制ICAM-1和TNF -α的釋放，可能是神經(jīng)元保護(hù)的作用機(jī)制之一。

腦出血；腦組織病理；細(xì)胞間黏附分子-1；腫瘤壞死因子-α；三七總皂苷

1 實驗材料

1.1 動物及分組 SD雄性大鼠，體重250～310 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司SPF／VAF級，合格證號：SCXK（京）2007-0001，實驗動物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和三七總皂苷組。

1.2 藥物及試劑 Ⅶ型膠原酶：Sigma公司美國；三七總皂苷注射液：注射用血栓通凍干粉，購自廣西梧州制藥股份有限公司（批號：070911），規(guī)格：150 mg／支，使用時用0.9%生理鹽水新鮮配置為10 mg／mL；0.9%生理鹽水：北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司（批號：0706271W），規(guī)格：500 mL∶4.5 g；水合氯醛：北京化學(xué)試劑公司（批號：050308），用生理鹽水制成10%濃度；多聚甲醛：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司（批號：20060712），使用時配置為4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉／氫氧化鈉溶液，pH7.2～7.4；大鼠ICAM-1定量EIA試劑盒：北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子-α定量酶聯(lián)檢測試劑盒：北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 SN-2型腦立體定位儀：Narishige Scientific Lab日本；微量進(jìn)樣器（0～5μL）：寧波市鎮(zhèn)海玻璃儀器廠中國；電子天平PW-3型：上海凱士電子有

限公司中國；電子天平（32212）：上海精密科學(xué)儀器有限公司中國；石蠟切片機(jī)：Leica RM2135德國；顯微鏡：Olympus BX60日本；SPO-Ⅱ數(shù)碼成相軟件：美國；數(shù)碼相機(jī)：SONY T7光學(xué)變焦3.0日本；酶標(biāo)儀：DENLEY DRAGONWellscan MK：Thermo芬蘭；分析軟件：Ascent software for Multiskan；洗板機(jī)：Wellwash 4 MK2：Thermo芬蘭；數(shù)字顯示隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYXDHS：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠中國；離心機(jī)TGL-168（編號11-07）：上海安亭科學(xué)儀器廠中國；P200微量可調(diào)移液器（規(guī)格20～200μL）：Thermo labsystems芬蘭。

2 實驗方法

2.1 造模 動物用10%水合氯醛（0.4 mg／kg）腹腔麻醉，俯臥位固定在腦立體定位儀上，將頭背部皮膚消毒后，切開頭部正中皮膚，暴露顱骨，參照包新明《大鼠腦立體定位圖譜》［1］，以大鼠前囟為“0”點，橫坐標(biāo)向右開3 mm，向前開1 mm，鉆開顱骨，直徑1 mm，將微量注射器取1μL膠原酶（含有膠原酶1U）固定于腦立位儀上，垂直向下進(jìn)針5.5 mm，即尾狀核部位。3 min內(nèi)注完膠原酶，留針7 min，緩慢退出，用少量慶大霉素防止感染，縫合切口，分籠飼養(yǎng)。假手術(shù)組動物以微量進(jìn)液器內(nèi)不加入任何液體，余操作同膠原酶造模組。采用標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自由飲水。

2.2 給藥 造模后立即ip給藥1次，1次／d，連續(xù)7 d，直至取材前1 d。給藥組予三七總皂苷注射液72 mg／kg（10 mg／mL），模型組和假手術(shù)組給予0.9%生理鹽水7.2 mL／kg。

2.3 取材方法 各組動物分別于造模后48 h、7 d經(jīng)10%水合氯醛麻醉，從深麻醉后仰臥固定，迅速剪開胸壁，暴露心臟，經(jīng)心臟用150 mL生理鹽水灌洗至血液沖盡，換用4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉／氫氧化鈉灌注固定，灌注速度先快后慢，到大鼠四肢及尾巴伸直變硬灌注完成。斷頭取腦，沿注射膠原酶進(jìn)針孔冠狀切開，將腦組織置入4%多聚甲醛-磷酸二氫鈉／氫氧化鈉中固定24 h，沿血腫冠狀面切下厚2 mm的腦片，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，連續(xù)作厚度為5μm的石蠟切片制備用于HE染色。7 d組腹主動脈取血，做雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附實驗。

2.4 HE染色 HE染色步驟如下：石蠟切片常規(guī)脫蠟至脫水。流水沖洗10 min。蘇木素染色20 min。充分水洗。0.5%伊紅染液5 min。流水沖洗10 min。滴度乙醇脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片。光鏡下觀察血腫面積大小、血腫及其周圍組織的病理學(xué)變化等。圖片見附圖。

2.5 雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附實驗 主要步驟如下：實驗前20 min從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫（20～25℃）。取出所需數(shù)量的板條，其余密封放回4℃。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔中各加入樣品稀釋液100μL，第一孔加標(biāo)準(zhǔn)品100μL，混勻后用加樣器吸出100μL，移至第二孔。如此反復(fù)作對倍稀釋至第七孔，最后，從第七孔中吸出100μL棄去，使之體積均為100μL。第八孔為空白對照。加樣：待測品孔中每孔各加入待測樣品100μL。將反應(yīng)板置37℃，120 min。洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干。每孔中加入第一抗體工作液（ICAM-1 100μL／TNF-α50μL）。將反應(yīng)板置37℃，60 min。洗板：同前。每孔中加酶標(biāo)抗體工作液100μL。將反應(yīng)板置37℃，60 min。洗板：同前。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)5～10 min。每孔加入1滴終止液混勻。在492 nm處測吸光值（應(yīng)盡快，時間過長可能導(dǎo)致本底偏高）。結(jié)果計算與判斷：所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。ICAM-1：以標(biāo)準(zhǔn)品2000、1000、500、250、125、62.5、31、0 ng／mL之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。TNF-α：以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.62、0 pg／mL之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將濃度作為X軸，OD值作為Y軸，曲線應(yīng)為一光滑曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線上查出相應(yīng)大鼠ICAM-1／TNF-α含量。

2.6 統(tǒng)計方法 采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)值采用表達(dá)，3組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較用t檢驗。

3 結(jié)果

3.1 HE染色發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組雙側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞排列整齊，胞漿淡染，核仁清楚（附圖1、4）。

模型組各標(biāo)本右側(cè)尾狀核均有大片出血灶，病灶邊緣血管擴(kuò)張，出血灶周圍腦組織顯著水腫，組織疏松，出血灶周圍有少量膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞腫大、疏松、空泡樣變性或皺縮；神經(jīng)纖維排列紊亂、皺縮及斷裂，出現(xiàn)空泡；大量炎性細(xì)胞浸潤，血管腔內(nèi)紅細(xì)胞聚集嵌塞微血管；7 d時出血灶可見含鐵血黃素顆粒，形成膠質(zhì)瘢痕結(jié)節(jié)，并出現(xiàn)空洞（附圖2、5）。三七總皂苷組出血灶部分吸收、機(jī)化，周圍腦組織水腫顯著減輕，神經(jīng)纖維排列紊亂現(xiàn)象顯著減輕（附圖3、6）。模型組和三七總皂苷組健側(cè)腦組織為正常組織形態(tài)。

3.2 造模7 d時，模型組血清中的ICAM-1含量增加（與假手術(shù)組比較P＝0.025），三七總皂苷組低于模型組（P＝0.031），三七總皂苷組含量與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.862）。造模7 d，TNF-α含量呈現(xiàn)模型組＞三七總皂苷組＞假手術(shù)組，但組間比較差異 均無統(tǒng)計學(xué)意義，如表1所示：

表1 造模7 d血清ICAM-1和TNF-α含量的組間比較（pg／mL）（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 ICAM-1含量（n＝8）TNF-α含量（n＝8）310.50±16.6 0.224±0.029模型組 350.50±39.30* 0.239±0.023三七總皂苷組 312.00±17.39△假手術(shù)組0.228±0.024

4 討論

膠原酶注射法誘導(dǎo)ICH，膠原酶對腦血管基底膜具有破壞作用，腦內(nèi)血管破裂，血液進(jìn)入腦組織內(nèi)。造模48 h后取材經(jīng)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察，紅細(xì)胞彌漫于基底核區(qū)并可見血腫的形成。血腫區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，變性壞死，細(xì)胞皺縮濃染，血腫周圍區(qū)內(nèi)可見組織疏松，細(xì)胞不同程度水腫。作為機(jī)體的一種防御反應(yīng)，出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤和小膠質(zhì)細(xì)胞激活?；罨陌准?xì)胞可發(fā)生流變學(xué)改變，表現(xiàn)為變形性降低和黏附性、聚集性增高，嵌塞微血管，導(dǎo)致微循環(huán)有效面積減少。健側(cè)無明顯上述改變。隨著出血后病程的發(fā)展，機(jī)體進(jìn)行損傷后的修復(fù)。在出血后7 d，在基底核出血區(qū)可見膠質(zhì)瘢痕形成，由于小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬了大量的紅細(xì)胞，形成了含鐵血黃素顆粒。三七總皂苷組血腫體積小于模型組，提示三七總皂苷有一定促進(jìn)血腫吸收的作用。本實驗造模后腦組織可見血腫、組織水腫和纖維化，因此組織病理學(xué)上符合血瘀征象。此外，HE染色觀察到炎性細(xì)胞浸潤也證實了腦出血急性期炎性反應(yīng)較劇烈。

ICH后存在明顯的炎性反應(yīng)，ICAM-1和TNF-α不同程度升高，可能加重繼發(fā)性腦損傷。早期使用三七總皂苷可促進(jìn)ICH后神經(jīng)功能缺損的恢復(fù)，抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)ICAM-1的表達(dá)，一定程度下調(diào)TNF-α，減輕神經(jīng)元損傷可能是三七總皂苷的治療機(jī)制之一。何氏［2］報道三七總皂苷可抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注后ICAM-1表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤，減輕腦梗死區(qū)炎性反應(yīng)，主要機(jī)制為抑制炎性反應(yīng)遞質(zhì)釋放和降低血腦屏障通透性，減輕腦水腫，提示三七總皂苷有一定的抗炎作用。ICH后血腫周圍炎性反應(yīng)的前提條件是炎性細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，黏附分子是介導(dǎo)黏附的重要因素，其中ICAM-1起著核心作用，也介導(dǎo)炎性細(xì)胞參與血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞損害的病理過程。ICH早期ICAM-1廣泛分布于上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，其中以血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)最強，引起中性粒細(xì)胞浸潤，釋放大量活性氧，參與繼發(fā)腦損傷［3］。同時，表達(dá)ICAM-1的白細(xì)胞活化后產(chǎn)生大量的蛋白水解酶，特別是基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），氧自由基、花生四烯酸代謝產(chǎn)物等，增加血腦屏障通透性，形成血管源性腦水腫［4］。正常情況下，ICAM-1可以在內(nèi)皮細(xì)胞有低水平的表達(dá)，但在炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IFN-γ等刺激下表達(dá)可明顯增高。ICAM-1還可以從血管內(nèi)皮細(xì)胞表面脫落，成為可溶性細(xì)胞間黏附分子-1（soluble-ICAM-1，sICAM-1），但仍保持與LFA-1結(jié)合的功能，缺血性卒中患者血清中可溶性ICAM-1的水平與腦組織、血腦屏障的損壞程度有關(guān)［5］。實驗研究證明，大鼠ICH后24 h血管內(nèi)皮出現(xiàn)ICAM-1，7 d達(dá)高峰，持續(xù)2周［6］。

ICH后神經(jīng)元、星形細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均可產(chǎn)生TNF-α，它是炎性反應(yīng)的觸發(fā)因子，一方面腦組織損傷后星形細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞首先表達(dá)TNF-α，另一方面由TNF-α可直接促進(jìn)中性粒細(xì)胞向病灶區(qū)聚集，誘導(dǎo)白細(xì)胞、受損組織細(xì)胞釋放更多的細(xì)胞因子，這是前炎性反應(yīng)細(xì)胞因子形成的一個正反饋機(jī)制。TNF-α還具有神經(jīng)毒性作用，表達(dá)增加可加速細(xì)胞死亡。而TNF-α神經(jīng)毒性和促細(xì)胞死亡的作用可能會使血腦屏障破壞，通透性增加，引起腦水腫［7］。7 d時血清TNF-α雖成模型組＞三七總皂苷組7＞假手術(shù)7的趨勢，但并無統(tǒng)計學(xué)意義，查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TNF-α在ICH后24～72 h之間達(dá)到高峰，之后下降，故考慮此陰性結(jié)果與造模7 d時TNF-α已自行下降有關(guān)。

［1］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：24-48.

［2］何蔚，朱遵平.三七總皂苷對大鼠腦梗死區(qū)ICAM-1表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤的影響［J］.中藥材，2005，28（5）：403-405.

［3］智迄惠，黎杏群，羅云，等.NF-κB及ICAM-1在腦出血大鼠及過氧化氫損傷大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)［J］.中國病理生理雜志.2007，23（4）：693-698.

［4］梁志剛，劉兆孔，高曉蘭，等.腦出血大鼠血腫周圍腦組織細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)與腦水腫的關(guān)系［J］.臨床神經(jīng)雜志，2006，19（1）：67 -69.

［5］Pleines UE，Stover JF，Kossmann T，etal.Soluble ICAM-1 in CSF coincides with the extent of cerebral damage in patientswith severe traumatic brain injury［J］.Neurotrauma，1998，15（6）：399-409.

［6］Chao g，Julian T H，RICHard F K.Acute inflammatory reaction following experimental intracerebral hemorrhage in rats［J］.Brain Res，2000，871（1）：57-65.

［7］Castillo J，Davalos A，AIvarez-sabin J，et al.Molecular siguatures of brain injury after intracerebral hemorrhage［J］.Neurology，2002，58（4）：624-629.

（2013-04-09收稿）

The Effect of Early Use of Panax Notoginseng Saponins on Inflammation in Ratsw ith Cerebral Hemorrhage

Zhao Xuesong，Chen Zhigang，Xu Zhifang，Gao Fang
（Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China）

Objective：To study the effect of early use of Panax notoginseng saponins（PNS）on the pathomorphological brain tisssues，ICAM-1and TNF-αin rats with cerebral hemorrhage（ICH）.M ethods：SD rats were randomly divided into sham group，model group and PNSgroup，and ICH models weremade with collagenaseⅦinjected into the rats’caudate nucleus.Themorphological changes in the brain were observed.ICAM-1 and TNF-αin the serum were measured by the method of enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）.Results：The region around the hematoma infiltrated by inflammatory cellswas observed by HSstaining，and PNSsignificantly reduced the brain edema andameliorated disorderly arrangement of nerve fibers；On the 7th day after ICH，the level of ICAM-1 and TNF-αin the serum was still higher in themodel group compared with that in the sham group，and the administration of Panax notoginseng saponins down-regulated ICAM-1（P＜0.05）and TNF-α.Conclusion：Panax notoginseng saponins can alleviate the pathomorphological brain tissues of cerebral hemorrhage，and it could inhibit the release of ICAM-1 and TNF-αso as to protect the neurons.

Cerebral hemorrhage；Brain pathomorphology；ICAM-1；TNF-α；Panax notoginseng saponins

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.07.027腦出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）是一種最危重的卒中類型，具有發(fā)病急、變化快、病情危重、病機(jī)復(fù)雜等特點，臨床必須緊急救治，目前缺乏有效的、針對性強的治療手段。近年研究表明腦出血血腫周圍組織有炎性反應(yīng)存在，較非出血性腦損傷明顯，且在腦出血的繼發(fā)性損傷中具有重要意義。本研究用三七總皂苷（PNS）干預(yù)實驗?zāi)X出血大鼠，觀察其對腦組織病理形態(tài)的改變和炎性反應(yīng)遞質(zhì)的影響，為使用三七總皂苷早期治療腦出血提供理論依據(jù)和支持。

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（新教師類）（編號：2011001312001）；北京中醫(yī)藥大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊項目中醫(yī)腦病形神一體化防治研究團(tuán)隊（編號：2011-CXTD-23）

趙雪松（1981—）男，在讀博士研究生，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)腦病，E-mail：13811347860＠139.com

陳志剛（1964—），男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，碩士，研究方向：中醫(yī)內(nèi)科學(xué)腦病，E-mail：zgchen01＠yahoo.com.cn