王玉杏 徐鷗 劉硯星 黃河銀 路虹

聽(tīng)覺(jué)剝奪大鼠聽(tīng)皮層BDNF和Trk B的表達(dá)變化△

王玉杏1徐鷗1劉硯星2黃河銀1路虹1

目的通過(guò)建立聽(tīng)覺(jué)剝奪（auditory deprivation，AD）的動(dòng)物模型，探討腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brainderived neurotrophic factor，BDNF）和其功能性受體酪氨酸激酶B（tropomyosin receptor kinase B，Trk B）與聽(tīng)皮層可塑性的關(guān)系。方法 48只SD大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組24只，采用耳后切口暴露聽(tīng)泡并打開(kāi)，實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)耳蝸損毀術(shù)建立大鼠AD模型，對(duì)照組不損毀耳蝸。于術(shù)后2 w分別檢測(cè)兩組動(dòng)物ABR反應(yīng)閾，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，于術(shù)后2、4、6、8 w測(cè)定兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF和Trk B基因mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 術(shù)后2 w，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物雙耳ABR反應(yīng)閾明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；聽(tīng)覺(jué)剝奪后，聽(tīng)皮層BDNF與TrkB有相同的表達(dá)變化趨勢(shì)，除術(shù)后6 w外，實(shí)驗(yàn)組第2、8 w BDNF與TrkB基因mRNA和蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組（P＜0.05），而第4 w二者的表達(dá)量高于對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論 BDNF通過(guò)與功能性受體Trk B結(jié)合，參與聽(tīng)皮層神經(jīng)元可塑性的調(diào)節(jié)，可能對(duì)神經(jīng)元的損害具有代償性修復(fù)作用。

聽(tīng)覺(jué)剝奪； 腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子； 酪氨基激酶B； 可塑性； 聽(tīng)皮層

研究表明，聽(tīng)覺(jué)中樞能夠在外周聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)損害或聽(tīng)覺(jué)訓(xùn)練后產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，這種聽(tīng)覺(jué)中樞隨外界變化而變化的能力稱作“可塑性”［1］，其在出生后的腦發(fā)育階段最明顯，稱“關(guān)鍵期”［2］。

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族中的重要成員之一，大量產(chǎn)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)特定的神經(jīng)元內(nèi)。BDNF通過(guò)與細(xì)胞膜特異性受體酪氨酸激酶B（tropomyosin receptor kinase B，Trk B）結(jié)合，不僅可促進(jìn)發(fā)育中的神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)，維持神經(jīng)元正常的生理功能以及突觸的傳遞，而且對(duì)成年期神經(jīng)元具有抗損傷性刺激，促進(jìn)神經(jīng)元再生和修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的重要作用［3］。本實(shí)驗(yàn)擬采用雙側(cè)耳蝸損毀手術(shù)制作聽(tīng)覺(jué)剝奪（auditory deprivation，AD）動(dòng)物模型，觀察BDNF和Trk B在大鼠聽(tīng)皮層的表達(dá)變化，探討B(tài)DNF-Trk B信號(hào)通路在聽(tīng)皮層發(fā)生可塑性變化過(guò)程中所起的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及聽(tīng)覺(jué)剝奪模型的建立 48只兩周齡健康雄性SD大鼠（由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供），雙側(cè)外耳道通暢，無(wú)耳疾，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各24只。實(shí)驗(yàn)組行雙側(cè)耳后切口，暴露聽(tīng)泡并打開(kāi)，窺見(jiàn)耳蝸并損毀之；對(duì)照組在相同條件下做雙側(cè)耳后切口并打開(kāi)聽(tīng)泡，但不損毀耳蝸。按術(shù)后存活時(shí)間每組動(dòng)物又分別分為4個(gè)小組，即術(shù)后2、4、6、8 w組，每組6只，分籠喂養(yǎng)于屏障環(huán)境中。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組動(dòng)物分別于術(shù)后2 w進(jìn)行ABR檢測(cè)。動(dòng)物以5%水合氯醛（10 ml／kg）腹腔注射麻醉，麻醉后置于隔聲屏蔽室內(nèi)，采用美國(guó)ICS聽(tīng)性腦干誘發(fā)電位儀檢測(cè)，刺激聲為短聲，極性為交替波，速率為21.1／s，增益為50 k，以可引出波Ⅲ的最小刺激強(qiáng)度定為ABR反應(yīng)閾。

1.2.2 免疫組織化學(xué)取材及染色 每組動(dòng)物各取3只制作石蠟標(biāo)本。動(dòng)物以5%水合氯醛（10 ml／kg）腹腔注射麻醉，心臟灌注，取出整個(gè)大腦置于4%多聚甲醛中后固定24 h。固定后二次取材，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋步驟制成石蠟塊。參照大鼠腦立體定位圖譜確定聽(tīng)皮層區(qū)域，用石蠟切片機(jī)連續(xù)切片。切片經(jīng)脫蠟、水化后，抗原修復(fù)；H2O2封閉；血清封閉；加一抗工作液（兔抗鼠BDNF多克隆抗體，Santa Cruze，SC-20981；兔抗鼠TrkB多克隆抗體，Bioworld，BS1431；稀釋比例1：100）；加二抗工作液；加HRP標(biāo)記的鏈霉親和素；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。除血清封閉外，余步驟孵育后用0.01 M PBS漂洗。陰性對(duì)照用0.01 M PBS代替一抗，余同上。以細(xì)胞胞膜和軸突存在棕黃色顆粒定為陽(yáng)性細(xì)胞，用Image Pro Plus 5.1圖像處理軟件分析圖片陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度值（AOD）。

1.2.3 RT-PCR取材和檢測(cè) 每組動(dòng)物各取3只，斷頭處死，快速取出聽(tīng)皮層置于Trizol內(nèi)，保存于-80℃?zhèn)溆?。采用RT-PCR法檢測(cè)基因：提取總RNA，測(cè)定RNA純度，反轉(zhuǎn)錄，RT-PCR：用AB 7500型熒光定量PCR儀，采用20μl反應(yīng)體系，β-actin作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。根據(jù)原始檢測(cè)結(jié)果（ct值，ct值越高，其表達(dá)越弱），采用2-ΔΔct分析法分析BDNF和T2KB mRNA的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx± s）表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABR檢測(cè)結(jié)果 術(shù)后2 w對(duì)照組大鼠雙耳ABR反應(yīng)閾為20.21±4.29 dB SPL，AD組雙耳ABR反應(yīng)閾為91.33±5.32 dB SPL，兩組間比較，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組大鼠聽(tīng)皮層BDNF與Trk B的mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，除術(shù)后6 w組外，2、4、8 w組BDNF與TrkB的mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1、表2）。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組聽(tīng)皮層均有BDNF和TrkB蛋白表達(dá)，主要定位于胞膜和軸突。AD組BDNF與Trk B蛋白表達(dá)量在術(shù)后2 w降低，4 w增多，之后下降，峰值在4 w；對(duì)照組蛋白表達(dá)在術(shù)后2 w最多，之后下降并保持在一定水平。實(shí)驗(yàn)組各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），除6 w組外，2、4、8 w組與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3、圖1、圖2）。

表1 術(shù)后不同時(shí)間兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF與Trk B RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

表1 術(shù)后不同時(shí)間兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF與Trk B RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

檢測(cè)時(shí)間BDNF實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組TrkB實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組術(shù)后2 w 25.69±0.40*24.48±0.32 25.59±0.51*25.45±0.52 24.62±0.40術(shù)后4 w 24.49±0.24*25.36±0.32 25.04±0.30*25.64±0.62術(shù)后6 w 25.50±0.43 25.32±0.58 25.39±0.40 25.61±0.59術(shù)后8 w 26.60±0.29*25.31±0.26 26.44±0.34*

表2 實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后不同時(shí)間聽(tīng)皮層BDNF與TrkB m RNA表達(dá)水平（2-ΔΔct）

表3 術(shù)后不同時(shí)間兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF與TrkB蛋白表達(dá)的平均光密度值

表3 術(shù)后不同時(shí)間兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF與TrkB蛋白表達(dá)的平均光密度值

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

檢測(cè)時(shí)間BDNF實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組TrkB實(shí)驗(yàn)組 對(duì)照組術(shù)后2 w 0.311±0.051*0.543±0.050 0.343±0.039*0.323±0.026 0.546±0.029術(shù)后4 w 0.623±0.032*0.334±0.026 0.619±0.026*0.323±0.022術(shù)后6 w 0.342±0.046 0.332±0.027 0.311±0.039 0.325±0.025術(shù)后8 w 0.226±0.021*0.328±0.031 0.236±0.056*

圖1 兩組大鼠聽(tīng)皮層BDNF免疫組織化學(xué)染色圖片（SP×200）

圖2 兩組大鼠聽(tīng)皮層TrkB經(jīng)免疫組織化學(xué)染色圖片（SP×200）

3 討論

聽(tīng)覺(jué)經(jīng)歷在聽(tīng)覺(jué)中樞的發(fā)育過(guò)程中扮演著非常重要的角色［4］。研究發(fā)現(xiàn)，幼年小鼠在接受特定音調(diào)的聲音刺激一段時(shí)間后，初級(jí)聽(tīng)皮層此頻率聲音的代表區(qū)域擴(kuò)大［5］。在幼鼠發(fā)育階段，耳蝸損毀可導(dǎo)致聽(tīng)皮層結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生適應(yīng)性改變，在雙側(cè)耳蝸損毀的大鼠，自聽(tīng)覺(jué)剝奪效應(yīng)產(chǎn)生起，蝸神經(jīng)核便出現(xiàn)了神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象，并持續(xù)發(fā)展，直到4個(gè)月時(shí)各核群體積明顯縮小，神經(jīng)元數(shù)量明顯減少［6］。神經(jīng)元數(shù)量的減少進(jìn)一步導(dǎo)致聽(tīng)皮層發(fā)生可塑性的改變，其原因可能與聽(tīng)皮層內(nèi)源性BDNF和Trk B的表達(dá)變化及其神經(jīng)保護(hù)作用降低有關(guān)［7］。

大鼠聽(tīng)力發(fā)育的關(guān)鍵期在生后12天開(kāi)始，30天結(jié)束［8］，國(guó)此本實(shí)驗(yàn)選擇出生后2 w的大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Tan等［9］發(fā)現(xiàn)耳聾幼鼠聽(tīng)皮層內(nèi)BDNF的表達(dá)下降，而在耳蝸植入重獲聽(tīng)力之后，雙側(cè)聽(tīng)皮層BDNF表達(dá)水平明顯提高。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠在聽(tīng)覺(jué)發(fā)育期（生后4 w，即術(shù)后2 w）BDNF和TrkB的基因和蛋白表達(dá)均降低，提示BDNF和TrkB可能對(duì)聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)元的發(fā)育發(fā)揮重要作用，進(jìn)而維持聽(tīng)皮層正常的可塑性。

研究表明，在缺乏聽(tīng)覺(jué)信號(hào)刺激的新生大鼠外側(cè)上橄欖核中，突觸的發(fā)育過(guò)程只是部分受阻，并沒(méi)有完全終止［10］，這提示AD對(duì)大鼠聽(tīng)皮層的發(fā)育可能只是起到延緩作用，而非終止效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠聽(tīng)皮層BDNF與Trk B的最高表達(dá)量出現(xiàn)在2 w，而大鼠聽(tīng)覺(jué)剝奪沒(méi)有聲音信號(hào)刺激的情況下，聽(tīng)皮層BDNF和TrkB的表達(dá)在4 w時(shí)增多，這可能是BDNF-TrkB的代償性改變，起到抵抗神經(jīng)元細(xì)胞退化的作用。

本研究顯示，對(duì)照組大鼠在出生后早期，聽(tīng)皮層BDNF對(duì)聲音刺激極其敏感，2 w時(shí)表達(dá)最高，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育；Trk B作為BDNF的功能受體，最高表達(dá)量也出現(xiàn)在2 w，提示BDNF的促發(fā)育機(jī)制可能與BDNF-Trk B信號(hào)激活有關(guān)。而聽(tīng)覺(jué)剝奪大鼠在沒(méi)有聲信號(hào)刺激時(shí)也出現(xiàn)BDNF與Trk B的表達(dá)增多，且峰值在4 w，其原因可能為：①聽(tīng)皮層受到視覺(jué)等其他感覺(jué)刺激的影響產(chǎn)生了“交叉可塑性”變化，即鄰近的其他感覺(jué)皮層神經(jīng)元向聽(tīng)皮層延伸，并占據(jù)其位置；②神經(jīng)元本身情況的不同，在早期，神經(jīng)元處在生長(zhǎng)發(fā)育階段，而生后4 w幼稚的神經(jīng)細(xì)胞逐漸發(fā)育成熟，由于成熟神經(jīng)細(xì)胞表面Trk B受體表達(dá)不同，導(dǎo)致BDNF對(duì)細(xì)胞或突觸的選擇性。有研究發(fā)現(xiàn)TrkB截?cái)嗍荏w能夠隔離BDNF的作用，參與BDNF的轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)［11］。目前Trk B受體各亞型與BDNF結(jié)合的作用機(jī)制的研究還不完全清楚［12］，有待更進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物到術(shù)后8 w，聽(tīng)皮層BDNF和Trk B的表達(dá)明顯減少，說(shuō)明聽(tīng)覺(jué)剝奪后，隨聽(tīng)皮層“交叉可塑性”的完成，BDNF-TrkB所發(fā)揮的抵抗神經(jīng)元損傷的作用基本結(jié)束。此外，上述現(xiàn)象也反映了BDNF-Trk B參與聽(tīng)皮層神經(jīng)元可塑性變化的調(diào)節(jié)是一個(gè)緩慢的過(guò)程。因此，對(duì)于極重度聽(tīng)力損失的患兒，在聽(tīng)皮層神經(jīng)元可塑性損害較輕的時(shí)段植入人工耳蝸，有利于其重獲言語(yǔ)和交流的能力；而在聽(tīng)覺(jué)剝奪晚期，聽(tīng)皮層神經(jīng)元大量減少，聽(tīng)皮層的可塑性受到嚴(yán)重的破壞，依靠耳蝸植入重獲聽(tīng)力的可能性大大降低。而且，已有研究證實(shí)在聽(tīng)力喪失的早期接受耳蝸植入的兒童比晚期植入者能夠更快的重獲言語(yǔ)能力［13，14］。

BDNF-TrkB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)聽(tīng)皮層可塑性變化方面可能發(fā)揮著重要作用，而B(niǎo)DNF與受體Trk B各亞型結(jié)合的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（2013-01-06收稿）

（本文編輯 李翠娥）

Expression of BDNF and TrkB in Rat Auditory Cortex after Bilateral Cochlear Ablation

Wang Yuxing*，Xu Ou，Liu Yanxing，Huang Heyin，Lu Hong
（*Department of Otorhinolaryngology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To investigate the relationship between brain-derived neurotrophic factor（BDNF）and tropomyosin receptor kinase B（TrkB）and the plasticity of auditory cortex（AC）in auditory deprivation（AD）fo animal model.Methods Forty-eight SD rats were randomly divised into 2 groups（24 rats／group）.Experiment group received bilateral cochlear ablation while control group did not.AD model was established by bilateral cochlear ablation through retroauricular incision.Technology of real-time polymerase chain reaction（RT-PCR）and immunohistochemistry method were used to observe the expressions of BDNF and Trk B in AC at 2 wks，4 wks，6 wks and 8 wks after operation.Statistical analysis was conducted with SPSS 13.0 software.Results Bilateral cochlear ablation resulted in serious hearing loss and the threshold of ABR was significantly increased（P＜0.05）.The expression patterns of BDNF and TrkB in auditory cortex were similar with each other after auditory deprivation，which decreased at 2 wks，increased and peaked at 4 wks，and then decreased afterward.The difference between each AD group and control group was statistically significant（P＜0.05）except for 6 wks.Conclusion BDNF participates in the plasticity change of auditory cortex through BDNF-Trk B signal passway which may play critical roles in the impairment of neuron.

Auditory deprivation； Brain-derived neurotrophic factor； Tropomyosin receptor kinase B；Plasticity； Auditorycortex

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.016

時(shí)間：2013-5-9 13：58

R339.16

A

1006-7299（2013）04-0379-04

△ 河北省自然科學(xué)基金（C2011206036）和河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃（20110375）資助

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻咽喉科（石家莊 050000）； 2 河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室

王玉杏，女，河北人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槎苹A(chǔ)。

路虹（Email：luhong12112003＠yahoo.com.cn）

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130509.1358.003.html