丁聰聰

中藥配伍學(xué)理論認(rèn)為，中藥中的作用成分不只是微量元素和有機(jī)分子，也是微量元素與有機(jī)分子的相互結(jié)合物。醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，多種金屬離子與槲皮素螯合而成的配合物具有較高的穩(wěn)定性，能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞生長起到抑制作用。本次臨床研究對槲皮素鍺抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的效果進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 試劑 氧化鍺試劑，自制槲皮素，培養(yǎng)基為北京賽默飛世爾化學(xué)生物制劑公司生產(chǎn)的RPMI1640(HyClone)，Signa公司生產(chǎn)的四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，Signa公司生產(chǎn)的二甲基亞砜(DNSO)，吉諾生物醫(yī)藥公司生產(chǎn)的胰蛋白酶，杭州四季青生物技術(shù)材料公司生產(chǎn)的胎牛血清(低內(nèi)毒素，無噬菌體)，SH40003-12鏈霉素、青霉素(HyClone);其他試劑選用分析純。

1.1.2 細(xì)胞株 從中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫中購買的人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人食管癌細(xì)胞EC9706、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人子宮頸癌細(xì)胞Hela。

1.1.3 儀器 美國Dynex公司生產(chǎn)的Spectra Mr全波長酶標(biāo)儀，德國萊卡公司生產(chǎn)的倒置顯微鏡，美國SM公司生產(chǎn)的二氧化碳培養(yǎng)箱，蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備公司生產(chǎn)的CJ-2-F超凈工作臺，日本島津公司生產(chǎn)的UV-240可見光-紫外光光度儀，德國耐馳公司生產(chǎn)的STA 409型PC/PG差熱分析儀，CHN Perkins400型元素分析儀，F(xiàn)TS 3000紅外光譜儀。

1.2 槲皮素鍺的制備 甲醇50 ml，氧化鍺1 mmol，槲皮素1 mmol，調(diào)節(jié)甲醇鈉pH值為8.5，用帶冷凝管和磁力攪拌器的三口燒瓶，連續(xù)6 h回流加熱。用硅膠G板對反應(yīng)過程進(jìn)行監(jiān)控，完成反應(yīng)后，停止回流。在聚酰胺層析柱中加入反應(yīng)液，用水沖洗，用濃度不同的甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，將特定區(qū)間內(nèi)的洗脫液收集起來，將有機(jī)溶液使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，獲得橘黃色固體物質(zhì)，重新提取甲醇，以獲得深橘黃色固體。元素分析所獲得的固體，對目標(biāo)產(chǎn)物實(shí)施熱分析以及紅外、紫外光譜分析鑒定，使用滅菌水將其調(diào)制為10 mmol/L的液體，并在4℃的冰箱中保存該原藥儲存液，使用前以RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，使用0.22 μm的微孔過濾液對其進(jìn)行過濾處理。

1.3 槲皮素鍺對多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用 選擇處于對數(shù)生長過程的PC-3細(xì)胞、EC9706細(xì)胞、SPC-A-1細(xì)胞、Hela細(xì)胞，將細(xì)胞密度設(shè)置為每孔6×103個，在96孔板中接種，飽和濕度37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)生細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液吸棄，用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋液的槲皮素鍺加入實(shí)驗(yàn)組，濃度為10 μmol/L和100 μmol/L，再加入對照組溶劑中，每組6個復(fù)孔，每孔體積為200 μL。將培養(yǎng)板于72 h后取出，用倒置顯微鏡觀察記錄其形態(tài)學(xué)。分別加入20 μL/孔和5 g/LMTT后進(jìn)行4 h培養(yǎng)，上清液吸棄后加入250 μL/孔 DMSO，振蕩10 min，保證結(jié)晶完全溶解，波長 570 mm處的每孔光密度值用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。細(xì)胞增殖抑制率(IR)計(jì)算方法為:1-(藥物組光密度值/對照組光密度值)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 通過SPSS 17.0軟件對所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對患者數(shù)據(jù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

濃度不同的槲皮素鍺對于多種腫瘤細(xì)胞增殖的作用效果對比差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。如表1所示。

表1 濃度不同槲皮素鍺對于四種腫瘤細(xì)胞增殖的作用分析(%)

3 討論

本次研究結(jié)果表明，鍺和槲皮素在堿性環(huán)境下，能產(chǎn)生槲皮素鍺的配合物，經(jīng)過熱分析、紅外光譜分析、紫外光譜分析和元素分析，可確定為目標(biāo)產(chǎn)物［1］。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素鍺合成物體外作用，對于人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人食管癌細(xì)胞EC9706、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人子宮頸癌細(xì)胞Hela等多種腫瘤細(xì)胞的增殖過程具有明顯抑制作用，且隨著槲皮素鍺濃度的提高［2］，抑制作用效果也會逐漸提高。槲皮素有助于耐藥細(xì)胞在ADM中分布的恢復(fù)，但無法完全恢復(fù)腫瘤細(xì)胞自身耐藥性，對化療藥物的敏感株和敏感性對比仍存在一定差異［3］，其原因可能是腫瘤細(xì)胞自身的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，在同種類細(xì)胞中會同時出現(xiàn)不同的多種作用機(jī)制［4］?？梢?，槲皮素鍺具有較好且較廣泛的腫瘤抑制作用，可作為抗腫瘤藥物進(jìn)行開發(fā)研究［5］。

［1］方武.槲皮素對前列腺癌細(xì)胞的放療增敏性研究.四川醫(yī)學(xué)，2012，33(4):591-592.

［2］李洪福.抑制HSP 70表達(dá)對體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長的影響. 江蘇醫(yī)藥，2010，25(5):385-386.

［3］范宗榮.槲皮素對人腎癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖、侵襲及其VEGF表達(dá)的影響.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，47(8):889-890.

［4］單保恩.槲皮素對人子宮內(nèi)膜癌耐藥細(xì)胞株B-MD-C1(ADR+/+)多藥耐藥基因mdrl及p-gp蛋白表達(dá)的影響.癌變·畸變·突變，2009，21(5):256-257.

［5］鐘喜明.槲皮素對食管癌細(xì)胞侵襲和中期生長因子基因表達(dá)的影響.世界華人消化雜志，2008，16(22):2504-2505.