李江 張煒明 邱梁 邱雁

組織芯片在前列腺癌研究中的可靠性分析

李江 張煒明 邱梁 邱雁

目的探討前列腺癌組織芯片結(jié)果的可靠性。方法收集48例前列腺癌病例，構(gòu)建成直徑2.0 mm的組織芯片，進(jìn)行HE染色并重新評(píng)價(jià)Gleason得分，同時(shí)應(yīng)用免疫組化、原位雜交技術(shù)分別檢測(cè)EZH2，并對(duì)照常規(guī)石蠟組織切片結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果前列腺癌組織芯片Gleason評(píng)分與常規(guī)石蠟切片比較，兩者總體符合率為89.58%。前列腺癌組織芯片與常規(guī)石蠟切片比較，免疫組化結(jié)果一致率為95.65%（Kappa＝0.810）；原位雜交結(jié)果一致率為90.90%（Kappa＝0.727）。結(jié)論采用規(guī)范的組織芯片制作程序，直徑2.0 mm組織芯片上的組織樣本可以反映原組織結(jié)構(gòu)的信息，可作為一種可靠的、有代表性的高通量組織分子分析工具用于前列腺癌大樣本、回顧性的臨床病理學(xué)研究。

前列腺癌；組織芯片；免疫組化；原位雜交；EZH2

前列腺癌占?xì)W美國(guó)家男性主要死亡原因第二位，近年來(lái)隨著人口老齡化，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也呈明顯上升趨勢(shì)。臨床上亟待一種敏感的技術(shù)對(duì)前列腺癌早期診斷、治療、演進(jìn)趨勢(shì)及預(yù)后進(jìn)行評(píng)價(jià)，增加對(duì)前列腺癌本質(zhì)的認(rèn)識(shí)。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和新的檢測(cè)工具如基因芯片和蛋白芯片的廣泛應(yīng)用于腫瘤研究，新的基因和蛋白分子不斷被發(fā)現(xiàn)，然而對(duì)其功能的進(jìn)一步研究，還應(yīng)回到組織學(xué)水平。因而，先進(jìn)的組織學(xué)研究方法——組織芯片技術(shù)就顯得尤為重要。組織芯片在腫瘤研究中具有高通量、多樣本、省時(shí)快速、簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)［1］，但由于芯片上每個(gè)位點(diǎn)大小有限，同時(shí)前列腺癌細(xì)胞具有較大的異質(zhì)性，因此本文通過(guò)組織芯片與常規(guī)切片HE染色、免疫組化及原位雜交的結(jié)果比較對(duì)其進(jìn)行可行性分析。

1 對(duì)象與方法

1.1 供體蠟塊的選擇 選擇南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2005～2007年前列腺癌根治手術(shù)標(biāo)本48例，患者年齡50～81歲，平均（67.5±7.4）歲，術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療，標(biāo)本離體后均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，所收集病例均為前列腺腺泡癌，根據(jù)前列腺癌Gleason評(píng)分系統(tǒng)，Gleason≤6分18例，Gleason評(píng)分≥7分30例。

1.2前列腺癌組織芯片的構(gòu)建 復(fù)習(xí)HE切片，在相應(yīng)的蠟塊上標(biāo)記具有代表性的區(qū)域1～2個(gè)，參考文獻(xiàn)［2］，用組織芯片點(diǎn)樣儀（Beecher Instruments公司）在空白蠟塊上打孔，每個(gè)組織芯直徑2.0 mm，再在腫瘤蠟塊已做標(biāo)記的區(qū)域鉆取組織芯植入空白蠟塊相對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)，設(shè)計(jì)組織陳列點(diǎn)數(shù)共68個(gè)。待全部組織芯植入后，將組織芯片蠟塊置55℃烘烤2 h，使組織芯與受體蠟塊完全融合。冷卻至室溫后，凍存30 min，作4 μm連續(xù)切片，多聚賴氨酸玻片（福州邁新公司）撈片，62℃烘烤3 h，備用。

1.3 免疫組化 采用EnVision二步法，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色。試劑兔抗人多克隆抗體EZH2（克隆號(hào)6A10，濃縮型）購(gòu)自美國(guó)Zymed公司，工作液濃度為1∶100，操作參考試劑盒說(shuō)明書。

1.4 原位雜交 EZH2原位雜交mRNA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司，地高辛標(biāo)記的EZH2寡核苷酸探針由該公司合成，序列為：5′-CAGACTGGGAAGAAATCTGAGAAGGGACCAGTTTG-3′；5′-AAGTATGTCGGCATCGAAAGAGAAATGGAAATCCC-3′。原位雜交所使用蒸餾水、器皿均用DEPC水處理。以RNA酶預(yù)處理作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格參照產(chǎn)品說(shuō)明書。常規(guī)切片脫蠟梯度乙醇水化；3%H2O2滅活內(nèi)源性酶；3%胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；后固定后，在41℃恒溫箱中進(jìn)行預(yù)雜交3 h及雜交過(guò)夜處理；在37℃環(huán)境中依次滴加封閉液30 min，生物素化鼠抗地高辛60 min，SABC 20 min，生物素化過(guò)氧化物酶20min；各步驟間用PBS或SSC液漂洗，最后DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封固。

1.5 結(jié)果判斷

1.5.1 組織芯片與常規(guī)組織切片HE染色重新進(jìn)行Gleason評(píng)分：采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師重新對(duì)每個(gè)組織芯進(jìn)行Gleason評(píng)分并與相應(yīng)常規(guī)石蠟切片Gleason評(píng)分比較，相同記為符合，否則為不符合。

1.5.2 組織芯片與常規(guī)組織切片免疫組化及原位雜交評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：EZH2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞胞核中呈現(xiàn)有棕黃色細(xì)顆粒。EZH2 mRNA陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)有棕黃色細(xì)顆粒。采用雙盲法，由兩位病理科醫(yī)師對(duì)組織芯片上每個(gè)位點(diǎn)的免疫組化及原位雜交染色進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別記數(shù)每個(gè)位點(diǎn)高倍鏡下100個(gè)細(xì)胞，取其平均數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%為陰性，＞25%為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果一致性采用Kappa法分析。

2 結(jié)果

2.1 組織芯片的質(zhì)量 制作陣列蠟塊過(guò)程中，68個(gè)組織芯排列整齊，無(wú)一例缺失，用作HE染色、免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均有2片組織折疊，原位雜交實(shí)驗(yàn)過(guò)程中組織缺失1片，折疊2片，最終有效病例均為48例。

2.2 組織芯片HE染色結(jié)果 HE切片鏡下每一組織芯均可見(jiàn)具有診斷意義的腫瘤組織結(jié)構(gòu)，所有組織中，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色，核質(zhì)比清晰，細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)基本清楚。

2.3 組織芯片與常規(guī)切片中Gleason評(píng)分結(jié)果比較重新評(píng)價(jià)前列腺癌組織芯片的Gleason評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1，組織芯片與常規(guī)HE切片Gleason得分進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者總體符合率達(dá)到89.58%。

表1 組織芯片與常規(guī)HE切片染色中Gleason評(píng)分關(guān)系

2.4 組織芯片與常規(guī)切片免疫組化及原位雜交結(jié)果比較 EZH2蛋白、EZH2mRNA陽(yáng)性信號(hào)分別定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆?；驁F(tuán)塊（圖1，2）。組織芯片陽(yáng)性結(jié)果與常規(guī)切片陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白、EZH2 mRNA表達(dá)符合率分別為96.65%和90.90%。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Kappa系數(shù)分別為0.810、0.727，均在0.7以上，說(shuō)明兩者有較高的符合率，見(jiàn)表2。

圖1 免疫組化結(jié)果（IHC，EnVision×200）

圖2 原位雜交結(jié)果（ISH×200）

表2 組織芯片與常規(guī)切片EZH2蛋白、EZH2 mRNA結(jié)果比較（n）

3 討論

組織芯片又稱組織微陣列（tissue microarray，TMA），是將數(shù)十個(gè)乃至數(shù)以千計(jì)不同來(lái)源的組織樣品粘貼到同一張固相載體如玻璃片或硅片上，形成組織微陣列。在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行免疫組化、原位雜交、FISH和原位PCR等以了解病變組織與相應(yīng)正常組織內(nèi)靶基因或蛋白質(zhì)的細(xì)胞來(lái)源、分布特征和表達(dá)差異等。雖然該技術(shù)已在科研中得到廣泛應(yīng)用，但組織芯片的代表性和有效性仍被人們關(guān)注。

本研究結(jié)果顯示，無(wú)論在組織芯片還是常規(guī)切片中，EZH2蛋白和EZH2 mRNA的表達(dá)符合率均高于90%，Kappa系數(shù)均＞0.7。表明直徑2.0 mm的組織芯片中每個(gè)組織樣本，可以反映原始組織結(jié)構(gòu)的信息，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的偏差，從總體上是能夠代表普通組織研究的。Manley等［3］收集了Michigan大學(xué)腫瘤研究小組1995～2001年的前列腺癌病例1300例，用TMA技術(shù)對(duì)PSA、E-cadherin、p27及ki-67免疫組化表達(dá)進(jìn)行研究，同樣取得了滿意結(jié)果，進(jìn)行臨床、病理及分子水平的研究顯示，組織芯片上并不是每一個(gè)組織芯都能完全代表原來(lái)的組織結(jié)構(gòu)信息，但這細(xì)小的差異并不影響總體的結(jié)果，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有意義。本實(shí)驗(yàn)中，EZH2免疫組化和原位雜交在組織芯片中分別有2例和4例與常規(guī)切片結(jié)果有差異，在有差異的這幾例常規(guī)切片中，我們觀察到在同一張切片中不同區(qū)域的癌細(xì)胞免疫組化和原位雜交染色的強(qiáng)弱及陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分?jǐn)?shù)也有差別。另外在Gleason評(píng)分有差異的這幾例中，我們觀察到芯片中丟失了原來(lái)腫瘤部分信息，尤其在Gleason評(píng)分為5分、7分、9分中不符合率均較高，這些差異主要是由于腫瘤形態(tài)以及生物學(xué)特征的異質(zhì)性造成的。即使同一個(gè)腫瘤，在不同的腫瘤細(xì)胞間生物標(biāo)志的表達(dá)水平也不盡一致，特別在多組織起源的腫瘤中這個(gè)問(wèn)題很難避免，此外還由于標(biāo)本本身的客觀性差異和閱片者主觀判斷的不穩(wěn)定性造成的。

另外，組織芯片上標(biāo)本位點(diǎn)的丟失也是影響檢測(cè)結(jié)果可靠性的重要因素［4］。本實(shí)驗(yàn)中組織丟失和折疊，也不同程度影響了結(jié)果。以往的研究發(fā)現(xiàn)，在組織芯片切片和染色過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致大約15%～30%的芯片位點(diǎn)標(biāo)本的丟失［4］。為此，近年來(lái)有研究者就組織芯片檢測(cè)前列腺癌中腫瘤標(biāo)志物表達(dá)情況的有效性和可靠性進(jìn)行了探討［4］，建議增大樣本組織或采取2點(diǎn)甚至多點(diǎn)取材，可有效減少組織芯片和常規(guī)組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果的差異，提高組織芯片檢測(cè)的可靠性和有效性。取材時(shí)，準(zhǔn)確的組織定位是關(guān)鍵，其次用于芯片制作的組織樣本應(yīng)略厚于常規(guī)組織取材的樣本厚度，以3.0 mm厚為宜［1］。此外，若用水漂浮裱片，水溫過(guò)高易導(dǎo)致組織片移位。若使用石蠟切片輔助帶移系統(tǒng)進(jìn)行干裱片及紫外線燈烤片，同時(shí)再用0.1%E的多聚賴氨酸等預(yù)處理載玻片，能有效地避免制片過(guò)程中組織片的移位或脫落。組織芯片是否具有代表性以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，組織芯片樣本量及組織芯的面積的選擇也很關(guān)鍵，尤其腫瘤分化程度的差異大或腫瘤的異質(zhì)性明顯時(shí)更為重要。研究認(rèn)為，在直徑為2.0 mm的組織片上有約100 000個(gè)細(xì)胞，而直徑0.6 mm的組織片上僅有約30 000個(gè)細(xì)胞。在TMA設(shè)計(jì)中不是組織片的數(shù)量越多越好，目前，國(guó)際上常用的TMA的樣本量多為60～100個(gè)，組織片的直徑在2.0 mm左右［1］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)無(wú)論在HE染色還是免疫組化和原位雜交結(jié)果，通過(guò)對(duì)前列腺癌組織芯片和常規(guī)切片比較表明，直徑為2.0 mm的組織芯可以代表原組織用于前列腺癌的實(shí)驗(yàn)研究。該技術(shù)為前列腺癌臨床病理學(xué)研究提供了一種可靠的、快速、經(jīng)濟(jì)的高通量分析工具。

［1］ 燕曉雯，陳琴，石群立.組織芯片技術(shù)在病理學(xué)中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2003，16（4）：297-303.

［2］ 李江，范欽和，樊祥山，等.前列腺癌中EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖的關(guān)系［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25（6）：615-618.

［3］ Manley S，Mucci NR，De Marzo AM，et al.Relational database structure to manage high-throughput tissue microarray data and images for pathology studies focusing on clinical outcome：the prostate specialized program of research excellencemode［J］.AM JPathol，2001，159（3）：837-843.

［4］ Mucci NR，Akdas G，Manely S，et al.Neuroendocrine expression in metastatic prostate cancer：evaluation of high throughput tissuemicroarrays to detect heterogeneous protein expression［J］.Hum Pathol，2000，31（4）：406-414.

Analysis of the reliability of tissuem icroarray in the research of prostate cancer

LI Jiang，QIU Liang，QIU Yan．Department of Pathology，Jiangsu Provincial Geriatrics Hospital，Nanjing 210024，China；ZHANGWei-ming．Departmentof Pathology，the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

ObjectiveTo study the reliability of tissue chip in the research of human prostate cancer.MethodsTissuemicroarray（TMA）with 2.0 mm in diameter tissue core was constructed from forty-eight cases of human prostate cancer.Gleason score was reevaluated by HE staining.EZH2 was detected by immunohistochemical（IHC）technique，and in situ hybridization（ISH）technique.At the same time the stains on the tissuemicroarrays were compared with that from the routine paraffin section.ResultsComparing the Gleason scores of prostate cancer tissue chip with that of routine paraffin section，the overall coincidence rate was 89.58%.Immunohistochemical results showed that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 95.65%（Kappa＝0.810）.The result in situ hybridization suggested that the consistent rate of TMA and routine paraffin section was 90.90%（Kappa＝0.727）.ConclusionsTissuemicroarrays with 2.0 mm in diameter tissue core can represent full tissue section，if the tissuemicroarrays are constructed as standard method.As a reliable and high-throughout tool it could be set on large sample and retrospective clinipathological research in the application of human prostate cancer.

prostate cancer；tissuemicroarray；imunohistochemistry；in situ hybridization；EZH2

R 737.25

A

10.3969／j.issn.1003-9198.2013.01.015

2012-02-23）

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫(yī)院病理科（李江，邱梁，邱雁）；210029江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科（張煒明）