劉學(xué)紅，張 泳

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室，浙江 紹興 312000)

胚胎時(shí)期，舌組織的分化發(fā)育受到各種基因的調(diào)控。蛋白是基因的外在表達(dá)產(chǎn)物，相應(yīng)蛋白在組織細(xì)胞的表達(dá)分布規(guī)律能反映基因的活動(dòng)規(guī)律。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating nuclear antigen，PCNA)是一種在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，是目前能較好反映細(xì)胞增殖狀況的一個(gè)指標(biāo)［1］。C-fos屬于myc癌基因家族，編碼產(chǎn)物為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞生長、增殖、分化和信息傳遞等活動(dòng)［2］。Bax是Bcl-2家族的一員，參與細(xì)胞線粒體凋亡途徑，其陽性表達(dá)程度反映細(xì)胞的凋亡狀況［3－4］。目前關(guān)于PCNA、C-fos和Bax蛋白在動(dòng)物和人消化系統(tǒng)組織中的分布及病理作用機(jī)制研究較多［3－6］，但關(guān)于這3種蛋白在人胚胎舌組織發(fā)育過程中的表達(dá)、分布規(guī)律及作用機(jī)制國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過觀察人胚胎舌組織生長發(fā)育過程中3種蛋白的表達(dá)、分布規(guī)律，探討三者在舌組織分化、發(fā)育過程中的作用，為臨床先天畸形和口腔疾患的研究提供正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 胚胎收集 收集因意外原因造成人工流產(chǎn)、發(fā)育正常的人胚胎標(biāo)本共16例(采集標(biāo)本均獲得產(chǎn)婦本人同意)。根據(jù)產(chǎn)婦末次月經(jīng)、B超所測(cè)胎兒雙頂徑和人胚胎形態(tài)學(xué)特征等確定胎齡為7～16周。以每4周為1個(gè)月齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第2個(gè)月齡5例，第3個(gè)月齡6例，第4個(gè)月齡5例。

1.2 標(biāo)本制備 從胎尸內(nèi)取出舌標(biāo)本，用4℃生理鹽水沖洗舌組織，分別取舌體、舌尖和舌根組織各1塊，放入10%的中性甲醛水溶液中固定12 h后，取出流水沖洗30 min，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片片厚4 μm，每個(gè)標(biāo)本取4片，行免疫組織化學(xué)染色。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 所用試劑PCNA和Bax一抗小鼠抗人單克隆抗體、C-fos一抗兔抗人多克隆抗體及其輔助試劑盒均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。C-fos免疫組化染色采用SP法，即切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，正常山羊血清封閉，滴加一抗(抗體濃度為1∶120)，生物素化山羊抗兔血清(二抗)，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次)，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。PCNA和Bax免疫組化染色采用PV法:即切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性酶，微波抗原修復(fù)，滴加一抗(抗體濃度為1∶100)，PV9005(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次)，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡觀察。用PBS替代一抗、二抗作陰性對(duì)照，用已知陽性片作陽性對(duì)照。

1.4 圖像分析 切片經(jīng)染色后，PCNA和C-fos蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的細(xì)胞核呈淡黃色、黃色或深黃色，細(xì)胞膜/質(zhì)不著色;Bax蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞的細(xì)胞膜/質(zhì)呈淡黃色、黃色或深黃色，細(xì)胞核不著色。用NIS-DR專業(yè)圖像處理分析軟件(日本Nikon)分別測(cè)定舌尖、舌體和舌根某一高倍視野下上皮組織、肌組織和纖維組織內(nèi)PCNA和C-fos蛋白陽性染色細(xì)胞的數(shù)量，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)視野，對(duì)每份樣本的4張切片的3個(gè)視野陽性染色細(xì)胞數(shù)量取平均值，即得舌尖、舌體和舌根上皮組織、肌組織和纖維組織內(nèi)PCNA和C-fos蛋白陽性染色細(xì)胞平均數(shù)，把上述3個(gè)部位的上皮組織、肌組織和纖維組織內(nèi)PCNA和C-fos蛋白陽性染色細(xì)胞平均數(shù)相加后再除以3得到舌上皮組織、肌組織和纖維組織內(nèi)PCNA和C-fos蛋白陽性染色細(xì)胞平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCNA蛋白在舌組織中的表達(dá) 第2個(gè)月齡時(shí)，PCNA蛋白在人胚舌尖、舌體和舌根上皮組織層部分細(xì)胞、舌肌組織和纖維組織內(nèi)有少數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá)(圖1A)，其中舌尖最多，舌體次之，舌根最少。第3個(gè)月齡時(shí)，PCNA蛋白呈陽性或強(qiáng)陽性廣泛表達(dá)于舌上皮組織層，舌肌組織內(nèi)部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，其中舌尖最多，舌體和舌根相似(圖1B)。第4個(gè)月齡時(shí)，PCNA蛋白在舌尖、舌體和舌根上皮組織層內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較第3個(gè)月胎齡時(shí)期明顯減少，PCNA蛋白主要表達(dá)于上皮基底層少數(shù)細(xì)胞;在舌肌組織內(nèi)，與第3個(gè)月胎齡時(shí)期相比，PCNA蛋白陽性表達(dá)數(shù)量增多(圖1C、D)。因此人胚胎第2－4個(gè)月齡段，PCNA蛋白在舌上皮組織的陽性染色細(xì)胞數(shù)量有不同變化:先增高再降低(均P＜0.01);而舌肌組織和纖維組織內(nèi)PCNA蛋白陽性染色細(xì)胞數(shù)量則以第4個(gè)月齡最多，第3個(gè)月齡次之，第2個(gè)月齡最少(P ＜0.05)，見表1。

圖1 人胚第2～4個(gè)月齡時(shí)PCNA蛋白在舌組織中的陽性表達(dá)Fig.1 At the second，third and fourth month of human embryo，positive expression of PCNA protein in the tongue tissue

表1 PCNA和C-fos蛋白在人胚胎舌組織的陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 1 The number of PCNA and C-fos positive cells in human embryonic tongue tissue(，/Hp)

表1 PCNA和C-fos蛋白在人胚胎舌組織的陽性染色細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 1 The number of PCNA and C-fos positive cells in human embryonic tongue tissue(，/Hp)

PCNA C-fos胎齡/月 蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量 蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量上皮組織 肌組織和纖維組織 上皮組織 肌組織和纖維組織239 .10 ±13.44 22.30 ±6.57 25.10 ±7.91 24.50 ±4.674 26.00 ±9.02 32.40 ±14.72 17.40 ±2.80 28.00 ±7.75 F值20.20 ±7.13 17.20 ±8.99 0 03 8.987 5.270 8.426 1.497 P值 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05

2.2 C-fos蛋白在舌組織中的表達(dá) 第2個(gè)月齡時(shí)，C-fos蛋白在人胚舌組織內(nèi)無陽性表達(dá)。第3個(gè)月齡時(shí)，C-fos蛋白呈陽性或強(qiáng)陽性廣泛表達(dá)于舌上皮組織層，舌肌組織內(nèi)部分細(xì)胞呈陽性表達(dá)，其中舌尖最多，舌體和舌根相似(圖2A)。第4個(gè)月齡時(shí)，C-fos蛋白在舌尖、舌體和舌根上皮組織層內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)較第3個(gè)月胎齡時(shí)期明顯減少;在舌肌組織內(nèi)，與第3個(gè)月胎齡時(shí)期相比，C-fos蛋白陽性表達(dá)未見明顯變化(圖2B，表1)。

圖2 人胎第3、4個(gè)月齡時(shí)C-fos蛋白在舌組織中的陽性表達(dá)Fig.2 At the third and fourth month of human fetus，C-fos protein positive expression in the tongue tissue

2.3 Bax蛋白在舌組織中的表達(dá) Bax蛋白僅在第3個(gè)月胎齡時(shí)呈弱陽性表達(dá)于舌肌組織和上皮組織內(nèi)少數(shù)細(xì)胞(圖3)。

第2、3 個(gè)月齡舌組織內(nèi) PCNA、C-fos、Bax蛋白陰性對(duì)照結(jié)果見圖4。

3 討論

舌是口腔中的重要組織器官，在人類咀嚼、吞咽和語言表達(dá)等生理功能方面發(fā)揮著重要作用。舌的異常發(fā)育不僅影響上述生理功能，還常引起口腔鄰近組織器官的發(fā)育畸形，甚至影響消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的功能。研究人胚胎舌生長發(fā)育時(shí)期舌組織細(xì)胞增殖規(guī)律，有助于人們進(jìn)一步了解舌的生理功能和發(fā)病機(jī)制。人胚胎發(fā)育到第7周時(shí)，舌完全形成，位于口腔中央，在隨后的胚胎發(fā)育過程中，它參與吞咽羊水、口腔塑型等重要生理功能。

圖3 人胎第3個(gè)月齡時(shí)，Bax蛋白(↑)在舌組織中的弱陽性表達(dá)(免疫組織化學(xué)法 ×400)Fig.3 Atthe third month ofhuman embryo，Bax protein weak positive expression(↑)inthetongue tissue，using immunohistochemical methods×400

PCNA在進(jìn)化上高度保守，是一種在增殖細(xì)胞中合成或表達(dá)的核內(nèi)多肽，對(duì)DNA復(fù)制和調(diào)節(jié)起著重要作用［7］。C-fos與DNA結(jié)合具有直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的作用，在靜止細(xì)胞受到生長刺激時(shí)迅速表達(dá);在胚胎細(xì)胞的發(fā)育過程中，C-fos是一種細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子，對(duì)細(xì)胞的生長、分化及增殖起促進(jìn)作用［8］。也有研究表明，C-fos表達(dá)增加可能與凋亡的反應(yīng)性表達(dá)增強(qiáng)(促進(jìn)特異性細(xì)胞凋亡)有關(guān)［9］。本研究結(jié)果顯示，第2個(gè)月胚齡時(shí)，僅見PCNA蛋白在人胚舌上皮組織層部分細(xì)胞和舌肌組織內(nèi)少數(shù)細(xì)胞呈陽性表達(dá);第3個(gè)月胎齡時(shí)，PCNA和C-fos蛋白在上皮組織細(xì)胞陽性表達(dá)數(shù)量最多;第4個(gè)月胎齡時(shí)期，舌肌組織內(nèi)PCNA蛋白陽性表達(dá)數(shù)量繼續(xù)增高，C-fos蛋白陽性表達(dá)未見明顯變化。這提示舌肌組織細(xì)胞的增殖分化整體上晚于舌上皮組織細(xì)胞，人胚胎舌上皮組織細(xì)胞增殖分化的高峰期在第3個(gè)月胎齡段;人胚胎發(fā)育第2個(gè)月胚齡時(shí)，舌的上皮和肌組織等都處于發(fā)育的早期階段，細(xì)胞比較幼稚，大多數(shù)正處于細(xì)胞分化、增殖前物質(zhì)聚集、DNA合成的準(zhǔn)備階段，細(xì)胞增殖信號(hào)表達(dá)較低;到第3個(gè)月胎齡時(shí)，舌上皮組織細(xì)胞經(jīng)過前一段較長時(shí)期的物質(zhì)儲(chǔ)備，大部分細(xì)胞已具備增殖分化能力。為了滿足胚胎舌組織快速增殖分化發(fā)育的需要，在一些刺激因子的誘導(dǎo)調(diào)控下，促進(jìn)細(xì)胞增殖。結(jié)合Bax蛋白在舌組織內(nèi)部分細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為此期C-fos蛋白表達(dá)的增高與凋亡的反應(yīng)性表達(dá)增強(qiáng)無關(guān)，C-fos的身份可能是作為細(xì)胞分化的誘導(dǎo)因子，與DNA結(jié)合調(diào)節(jié)有轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子，活化細(xì)胞，刺激細(xì)胞增殖［8］。第4個(gè)月胎齡時(shí)，舌上皮組織內(nèi)PCNA和C-fos蛋白陽性表達(dá)下降，說明人胚胎舌上皮組織層基本發(fā)育完善。關(guān)于PCNA在胚胎舌組織發(fā)育中的表達(dá)規(guī)律，Nagata等［10］在小鼠胚胎舌發(fā)育的研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA蛋白陽性表達(dá)開始于胚胎發(fā)育的第9天舌枕部體節(jié)細(xì)胞，到胚胎發(fā)育的第11天，PCNA蛋白在舌肌組織細(xì)胞的陽性表達(dá)達(dá)峰值，隨后下降直到出生，這一結(jié)果與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，說明人和小鼠舌發(fā)育過程中，細(xì)胞增殖均遵循先升高再降低這一規(guī)律。

圖4 人胎第2、3個(gè)月齡時(shí)，舌組織內(nèi)PCNA、C-fos、Bax蛋白的陰性對(duì)照結(jié)果(免疫組織化學(xué)法 ×400)Fig.4 At the second and third months of human embryo，PCNA，C-fos and Bax protein negative control results in the tongue tissue，using immunohistochemical methods×400

Bax屬于Bcl-2家族成員，參與細(xì)胞線粒體凋亡途徑，生理作用是拮抗Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3－4］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第 2～4個(gè)月胎齡段，Bax蛋白僅在第3個(gè)月胎齡時(shí)的舌組織內(nèi)少部分細(xì)胞呈弱陽性表達(dá)。結(jié)果提示人胚胎舌組織細(xì)胞在發(fā)育的早期，細(xì)胞以增生為主，但分化發(fā)育的過程中肯定存在細(xì)胞凋亡，胚胎舌組織細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑可能不是Bax基因通路，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜合上述，我們認(rèn)為PCNA、C-fos參與調(diào)控人胚胎舌內(nèi)組織細(xì)胞的分化發(fā)育過程。

［1］LAGAPA J T，OKU Y，KAMIYA M.Immunohistochemical characterization of cellular proliferation in small intestinal hyperplasia of rats with hepatic Strobilocercus fasciolaris infection ［J］.J Comp Pathol，2008，139(1):34-39.

［2］SONG P S，KANG M K，NIU CH Y，et al.Expression of c-fos in gastric myenteric plexus and spinal cord of rats with cervical spondylosis［J］.World J Gastroenterol，2005，11(4):529-533.

［3］HSU W H，LEE B H，PAN T M.Red mold dioscorea-induced G2/M arrest and apoptosis in human oral cancer cells ［J］.J Sci Food Agric，2010，90(15):2709-2715.

［4］JACOB T，ASCHER E，HINGORANI A，et al.Glycine prevents the induction of apoptosis attributed to mesenteric ischemia/reperfusion injury in a rat model［J］.Surgery，2003，134(3):457-466.

［5］EL-ROUBY D H.Histological and immunohistochemical evaluation of the chemopreventive role of lycopene in tongue carcinogenesis induced by 4-nitroquinoline-1-oxide［J］.Arch Oral Biol，2011，56(7):664-671.

［6］MISHRA A，BHARTI A C，SALUJA D，et al.Transactivation and expression patterns of Jun and Fos/AP-1 super-family proteinsin human oral cancer［J］.Int J Cancer，2010，126(4):819-829.

［7］ABIKE F，TAPISIZ O L，ZERGEROGLU S，et al.PCNA and Ki-67 in endometrial hyperplasias and evaluation of the potential of malignancy［J］.Eur J Gynaecol Oncol，2011，32(1):77-80.

［8］YANG D H，SMITH E R，CAI K Q，et al.C-fos elimination compensates for disabled-2 requirement in mouse extraembryonic endoderm development［J］.Dev Dyn，2009，238(3):514-523.

［9］HERMANA D M，KIOIC E，HATA R，et al.Relationship between metabolic dysfunctions，gene responses and delayed cell death after mild focal cerebral ischemia in mice ［J］.Neuroscience，2001，104(4):947-955.

［10］NAGATA J，YAMANE A.Progressofcell proliferation in striated muscle tissuesduring development of the mouse tongue［J］.J Dent Res，2004，83(12):926-929.