羅德祥，梁曉燕，陳 麗，雷凱君，李子鴻

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

化癥止痛巴布劑處方是我院使用多年的抗癌止痛標(biāo)本兼治的臨床驗(yàn)方，由蟾酥、徐長(zhǎng)卿、三七、細(xì)辛、紅花、延胡索、制馬錢(qián)子、冰片等中藥組方[1]，具有清熱解毒、化痰散結(jié)、活血止痛、化攻毒的功效，對(duì)痰熱毒瘀互結(jié)所致癌痛有較好的療效。原臨床使用是將藥材粉碎為細(xì)粉制成散劑，用蜂蜜或水調(diào)勻成糊狀敷貼患處。為了提高療效和方便臨床使用，根據(jù)各味藥所處的地位和藥物成分的特性，擬將化癥止痛散各味藥采用合適方法提取后制成巴布劑。筆者通過(guò)正交試驗(yàn)探討化癥止痛巴布劑的乙醇提取工藝，以總浸出物和其主要有效成分丹皮酚的含量為指標(biāo)，尋找最佳提取工藝條件，并對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行有效控制。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，包括Waters 1525型高壓泵、717型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、2996型二極管陣列檢測(cè)器、Empower工作站（美國(guó)Waters公司）；Mettler AE200型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；H66025MC型超聲發(fā)生器（無(wú)錫市超聲電子設(shè)備廠）。丹皮酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為110708-200506）；徐長(zhǎng)卿對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為121514-200501）；其他藥材均購(gòu)自廣州致信藥業(yè)有限公司，經(jīng)鑒定為正品；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝設(shè)計(jì)

采用 L9（34）正交試驗(yàn)，設(shè)置乙醇濃度（因素 A）、乙醇用量（因素B）、回流時(shí)間（因素C）、提取次數(shù)（因素 D）4個(gè)因素，每個(gè)因素進(jìn)行3水平考察，以徐長(zhǎng)卿中有效成分丹皮酚的提取量及浸膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2 總浸出物測(cè)定

按處方比例精密稱(chēng)取各藥材粗粉共50 g，其中徐長(zhǎng)卿藥材8 g，共9份，分別按表1中的正交設(shè)計(jì)方案提取。精密稱(chēng)取提取液10 g，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置干燥箱內(nèi)105℃干燥至恒重后，置干燥器中冷卻0.5 h，迅速精密稱(chēng)定質(zhì)量，計(jì)算浸膏得率。浸膏得率(%)＝干膏重/樣品重×100%。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 丹皮酚含量測(cè)定[2-4]

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Xterra RP 18 柱(250 mm × 416 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈 - 水(55 ∶45)；流速：1.0 mL /min；檢測(cè)波長(zhǎng)：274 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 溶液制備

精密稱(chēng)取丹皮酚對(duì)照品5.2 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含丹皮酚0.208 mg的對(duì)照品溶液。按處方比例精密稱(chēng)取各藥材粗粉共50 g，其中徐長(zhǎng)卿藥材8 g，共9份，分別按表1中正交設(shè)計(jì)方案提取，精密吸取各正交設(shè)計(jì)方案所得提取液1 mL，揮干溶劑后用甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，即得供試品溶液。按比例稱(chēng)取不含徐長(zhǎng)卿的其他藥材，用70%乙醇回流提取，依照供試品溶液制備方法制備，即得陰性對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：分別吸取丹皮酚對(duì)照品溶液、5號(hào)供試品溶液、缺徐長(zhǎng)卿的陰性對(duì)照品溶液各20 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果丹皮酚對(duì)照品溶液、供試品溶液在相同時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)丹皮酚特征吸收峰，且與其他組分峰分離較完全，缺徐長(zhǎng)卿陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取丹皮酚對(duì)照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。并以對(duì)照品進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)、峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝49 983.51 X-450 172.87（r＝ 0.999 8）。結(jié)果表明，丹皮酚進(jìn)樣量在 0.208～2.08 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

回收率試驗(yàn)：精密量取同一供試品提取液10 mL，共6份，分為3組，分別加入丹皮酚對(duì)照品溶液適量，水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙猓⒍ㄈ萦?0 mL容量瓶中，精密量取10 μL進(jìn)樣，按擬訂方法檢測(cè)，計(jì)算得回收率為97.61%，RSD為1.36%。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取同一供試品提取液6份，按供試品溶液制備方法制備，在擬訂色譜條件下測(cè)定。結(jié)果丹皮酚平均含量為 1.41%，RSD為1.26%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：吸取同一供試品溶液 10 μL，分別于 0，2，4，8，12，24 h時(shí)依法測(cè)定。計(jì)算丹皮酚峰面積的 RSD為1.47%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 樣品含量測(cè)定

精密吸取1～9號(hào)供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算丹皮酚含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 高效液相色譜圖

表2 正交設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

按方差分析理論得方差分析結(jié)果，見(jiàn)表3至表5。由表2可見(jiàn)，影響丹皮酚提取量、浸膏得率及綜合得分的因素的大小順序分別為：A＞C＞D＞B，A＞C＞B＞D，A＞C＞D＞B。由表 3和表 4可見(jiàn)，乙醇濃度對(duì)丹皮酚提取量和浸膏得率均有顯著性影響，回流時(shí)間對(duì)丹皮酚提取量有顯著性影響。結(jié)合表5綜合得分方差分析結(jié)果，可得最優(yōu)醇提工藝為A2B2C1D3。但因因素D影響不明顯，并考慮節(jié)約生產(chǎn)成本，故確定優(yōu)選工藝為A2B2C1D2，即加入10倍量的70%乙醇回流提取2次，每次回流提取時(shí)間為1 h。

表3 丹皮酚含量方差分析

表4 浸膏得率方差分析

表5 綜合得分方差分析

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，以確保提取工藝合理可行，按上述最優(yōu)工藝條件A2B2C1D2，重復(fù)安排3批試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，按醇提工藝A2B2C1D2所提得的丹皮酚含量、浸膏得率都接近正交試驗(yàn)中的最大值。因此，此工藝穩(wěn)定，具有重復(fù)性和可操作性。

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

采用正交設(shè)計(jì)，確定了醇提工藝的最佳條件，即加入10倍量的70%乙醇回流提取2次，每次回流提取時(shí)間為1 h。正交試驗(yàn)結(jié)果分析，乙醇濃度對(duì)浸膏得率和丹皮酚提取量均有較大影響，乙醇濃度較低時(shí)提取的浸膏得率雖高，但丹皮酚含量卻較低；同時(shí)回流時(shí)間對(duì)丹皮酚提取量也有顯著性影響，時(shí)間越長(zhǎng)，提取量反而降低，這些可能與丹皮酚水溶性較差、熔點(diǎn)低而易揮發(fā)造成損失有關(guān)。

中藥復(fù)方制劑中的丹皮酚含量測(cè)定多采用高效液相色譜法，文獻(xiàn)報(bào)道多采用甲醇-水的流動(dòng)相系統(tǒng)，且比例各不相同，有80 ∶20，75 ∶25，55 ∶45，52∶48 等。本試驗(yàn)曾試驗(yàn)比較乙腈 -水、甲醇-水兩種流動(dòng)相，以乙腈-水為流動(dòng)相所得色譜峰峰形好，分離效果較優(yōu)，故本試驗(yàn)最終選擇乙腈-水(55∶45)為流動(dòng)相，獲得了較好的分離度。

參考文獻(xiàn)：

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