趙 明，陳 竹，張旭乾，劉 康，馮 剛，劉麗華，韓小偉

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院組織工程與干細(xì)胞研究所;2.南充市中心醫(yī)院病理科，四川 南充 637000)

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關(guān)節(jié)軟骨退行性變疾病，是一類具有高發(fā)病率和高致殘率的退行性關(guān)節(jié)疾病，以骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)最為常見［1］。目前尚缺乏有效的治療方法。其主要生化改變?yōu)檐浌羌?xì)胞凋亡，因此探索增殖過程中的軟骨細(xì)胞變化規(guī)律是研究關(guān)節(jié)軟骨破壞及變性的病理及治療的重要方面［2］。本次實(shí)驗(yàn)在司徒鎮(zhèn)強(qiáng)［3］曾采用的軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)方法基礎(chǔ)上改進(jìn)及創(chuàng)新，使培養(yǎng)方法簡單易行，并觀察體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞生物學(xué)特性變化，為關(guān)節(jié)軟骨缺損及退行性變防治及運(yùn)動醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 4 周齡新西蘭乳兔(川北醫(yī)學(xué)院動物中心提供)。

1.1.2 主要試劑 Ⅱ型膠原酶，胰蛋白酶(1∶250)，PBS 緩沖液(凱基生物)，胎牛血清(HYCLONE)，DMEM 培養(yǎng)液/高糖(HYCLONE)，青鏈霉素混合液(南京凱基生物)，RNA 提取試劑盒(Bioteke Corporation)，PCR 試劑盒(Fermentas)，Type Ⅱcollagen staining Kit(chondrex)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng) 取4 周齡新西蘭乳兔1 只(購買于川北醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心)，耳緣靜脈空氣栓塞致死，酒精消毒，剔除雙膝和雙肘關(guān)節(jié)的皮膚及肌肉，浸泡于含雙抗的PBS 中。在超凈臺上分離關(guān)節(jié)軟骨面，仔細(xì)清除軟骨表面滑膜，刀片削下軟骨，將其剪碎成1 mm3大小碎片，PBS 沖洗3 次后，置入50 mL 離心管中，然后加入等體積胰酶，置于37 ℃恒溫水浴消化，每5 min 振蕩1 次，45 min 后取出，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入等體積0.1%Ⅱ型膠原酶后，置于37 ℃恒溫水浴消化8 h。取20%FBS 加入離心管稀釋，離心，棄上清，再次加入20%FBS 入離心管稀釋，離心，棄上清，沉淀移入細(xì)胞瓶中，加20% FBS 10 mL 于瓶內(nèi)，靜置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 天更換1 次培養(yǎng)液。

1.2.2 兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng) 運(yùn)用倒置顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞匯合成片(約80% ～90%)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。倒去培養(yǎng)液，PBS 清洗1 次，加入0.25%胰蛋白酶2 mL，消化至細(xì)胞出現(xiàn)圓形，個別細(xì)胞開始浮游時加入10% FBS 2 mL 中和胰酶，吹打細(xì)胞使其散開形成軟骨細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后分瓶培養(yǎng)。

1.2.3 生長曲線測定 取生長良好的第1 代細(xì)胞，用0.25%胰酶消化制成懸液，以每孔濃度2 ×104/mL 接種，每孔接種1 mL，接種后在8 d 內(nèi)每天取3 孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔3 次，取平均值，繪制其生長曲線。

1.2.4 關(guān)節(jié)軟骨collagen Ⅱ，aggrecan DNA 水平檢測 總RNA 按照RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行提取，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以oligo(dT)作為引物合成cDNA，RT-PCR 檢測利用Fermentas 公司兩步法PCR 試劑盒進(jìn)行。

1.2.5 甲苯胺藍(lán)及番紅-O 染色觀察 ①甲苯胺藍(lán)染色:細(xì)胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出，PBS 沖洗，4 %中性甲醛固定10 min，用1%甲苯胺藍(lán)染色4 h，迅速用無水乙醇漂洗1 次，靜置于空氣中干燥，顯微鏡下觀察。②番紅-O 染色:細(xì)胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出用PBS 沖洗，4 %中性甲醛固定10 min，蘇木素染色3 min，水洗3 次，快綠染色5 min，鹽酸酒精分化3 s，水洗3 次，番紅-O染色3 min，梯度酒精脫水，干燥后顯微鏡下觀察。

1.2.6 關(guān)節(jié)軟骨合成aggrecan 及collagen Ⅱ能力的檢測 aggrecan 免疫熒光染色:細(xì)胞在蓋玻片上長滿成片(70% ～80%)后取出用PBS 沖洗，冷丙酮固定10 min，水洗3 次，正常血清(與二抗同源)封閉15 min，添加一抗4 ℃過夜，PBS 水洗3 次，添加生物素化二抗，PBS 水洗3 次，抗熒光淬滅劑封片。Ⅱ型膠原免疫組化染色按照TypeⅡcollagen staining Kit 進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

軟骨組織原代培養(yǎng)7 d 后，約少許細(xì)胞從軟骨邊緣游離爬行而出，貼壁生長。貼壁后的細(xì)胞圓形增大逐漸展開、變平、伸出短小的突出，外觀呈多角形，如圖1A 所示。14 d 后細(xì)胞胞核清楚，為圓形或橢圓形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞外基質(zhì)具有折光性，部分細(xì)胞重疊生長成細(xì)胞簇(集落)，單層生長的細(xì)胞呈典型鋪路石樣表現(xiàn)，如圖1B 所示。

2.2 傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代細(xì)胞(P0)數(shù)量長至80% ～90%左右進(jìn)行傳代，傳代細(xì)胞24 h 后即可貼壁，細(xì)胞充分鋪展，且生長分裂能力強(qiáng)于P0，一般5 ～7 d 可長滿呈單層分布，細(xì)胞形態(tài)仍以圓形，多角形為主。P1 及P2 細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于其它代，但隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞呈現(xiàn)梭型改變明顯，其增殖分裂能力下降，如圖2 所示。后呈現(xiàn)的顏色變化觀察，隨著傳代數(shù)目增多，軟骨細(xì)胞染色越淡，表明軟骨細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加產(chǎn)生了一定的變異，其分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力下降(圖7)。

3 討論

軟骨組織由軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及纖維組織構(gòu)成。軟骨組織可通過酶解的方式從中游離出軟骨細(xì)胞，但所需相關(guān)酶甚多(如:睪丸透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶、膠原酶等)，且常破壞軟骨細(xì)胞的活性，同時反復(fù)離心獲取細(xì)胞的操作也較復(fù)雜，增加了污染的幾率。本實(shí)驗(yàn)嘗試關(guān)節(jié)軟骨組織經(jīng)胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶消化后離心取沉淀組織塊靜置培養(yǎng)，3 d后約少許原代細(xì)胞緣軟骨組織邊緣爬出，7 d 可達(dá)60%左右，與以前研究者［3－4］采用方法相比，此方法操作簡單，污染機(jī)率小，獲得原代軟骨細(xì)胞數(shù)量多。但其距離應(yīng)用實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞數(shù)量尚不足，通過此方法游離出的原代軟骨細(xì)胞傳兩代后獲得的第二代軟骨細(xì)胞數(shù)量可滿足實(shí)驗(yàn)需求，PCR 技術(shù)鑒定二代軟骨細(xì)胞特有標(biāo)志基因表達(dá)正常，蛋白多糖及堿性糖氨聚糖的高表達(dá)表明其分泌活性高。因此通過軟骨組織貼壁方式獲得原代軟骨細(xì)胞是一種簡便易行的培養(yǎng)方法，且經(jīng)此方法獲得的傳二代軟骨細(xì)胞具有高活性。

本實(shí)驗(yàn)成功建立的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法為組織工程化軟骨奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。此方法可在短時間內(nèi)高效獲取大量軟骨細(xì)胞，但我們隨后對持續(xù)傳代的軟骨細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究后發(fā)現(xiàn)隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)及分泌基質(zhì)將發(fā)生改變。細(xì)胞形態(tài)由鋪路石或類三角型狀轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維狀，細(xì)胞出現(xiàn)指狀突起，軟骨細(xì)胞分泌的collagen II 越來越少。推測此現(xiàn)象的出現(xiàn)其一可能與細(xì)胞脫離了自身生理環(huán)境有關(guān)，失去了生理環(huán)境對軟骨細(xì)胞生長及分化的影響。其二與傳代本身有一定聯(lián)系，據(jù)Tamamura等［5］通過real-time PCR 測定傳代后的軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原和蛋白多糖變化發(fā)現(xiàn)傳代對細(xì)胞表型影響較大。其三與傳代時接種密度有關(guān)，剛傳代后的細(xì)胞一部分消化死亡，一部分緩慢貼壁，此時細(xì)胞數(shù)量過低，細(xì)胞接觸作用差，細(xì)胞自分泌功能較弱。本實(shí)驗(yàn)通過研究認(rèn)為選用3 代以內(nèi)軟骨細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究較可。但仍有學(xué)者研究各種保持細(xì)胞表型的方法，使體外實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞狀態(tài)更接近體內(nèi)細(xì)胞，如李文輝等［6］研究持續(xù)靜壓力和力學(xué)刺激對調(diào)控軟骨代謝和維持其胞外基質(zhì)正常表型的影響，此外還有運(yùn)用生物反應(yīng)器及添加生長因子［7］進(jìn)行培養(yǎng)。雖然以上方法對體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞表型維持都具有一定效果，但常需耗費(fèi)大量時間與經(jīng)費(fèi)。本實(shí)驗(yàn)方法經(jīng)濟(jì)、簡單且實(shí)用，在較短時間內(nèi)可獲得大量純化的兔軟骨細(xì)胞，能為關(guān)節(jié)軟骨缺損、退行性變治療及組織工程化軟骨研究提供充足的細(xì)胞來源。

［1］ Felson DT，Lawrence RC，Dieppe PA，et al.Osteoarthritis:new insights.Part 1:the disease and its risk factors［J］.Ann Intern Med，2000，133(8):635 －646

［2］ Masahiko K，Ginette RS，Aisha M，et al.Role of interleukin and tumor necrosis factorαin mat rix degradation of human osteoarthritic cartilage［J］.Art hritis ＆ Rheum，2005，52 (1):128 －135

［3］ 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版公司，1996.109

［4］ 俞永林，任志偉，喬 健，等.兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特征［J］.復(fù)旦學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006，33 (6):753

［5］ Tamamura Y，Iwamoto M.Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations［J］.J Orthop Res，2005，23(2):425 －432

［6］ 李文輝，侯筱魁.軟骨組織工程種子細(xì)胞及其培養(yǎng)方法［J］.中華創(chuàng)傷骨科雜志，2003，5(3):244 －246

［7］ 陳北北.體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞與生長因子的加入［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)雜志，2010，46(16):8568 －8571