趙 林，石興耀

(上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，上海嘉定 201800)

P27kip1蛋白作為抑癌基因近年來(lái)被廣泛研究，并被認(rèn)為是一種腫瘤標(biāo)志物及預(yù)后因子［1］。作為細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inbibitor，CDKI)家族的重要成員之一，P27kip1具有廣泛的生物活性，不僅可以抑制腫瘤生長(zhǎng)導(dǎo)致其凋亡，還可以調(diào)控腫瘤對(duì)于藥物的耐受以及預(yù)防炎癥對(duì)組織的損傷。一旦P27kip1蛋白表達(dá)降低或缺失時(shí)，細(xì)胞由G期進(jìn)入S期失去調(diào)節(jié)，細(xì)胞的增殖將不受控制，基因發(fā)生變異，從而導(dǎo)致腫瘤形成［2］。我們對(duì)手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中 P27kip1進(jìn)行檢測(cè)，探討P27kip1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)差異，并分析其與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集嘉定區(qū)中醫(yī)院外科2008年4月至2011年12月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌62例，患者術(shù)前未接受任何新輔助治療，男33例，女29例;年齡45～82歲，平均55.6歲(標(biāo)準(zhǔn)差8.81歲)。結(jié)腸26例，直腸36例;高分化32例，中分化18例，低分化14例;根據(jù)UICC標(biāo)準(zhǔn)TNM分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期12例(根據(jù)術(shù)前檢查行根治或姑息性手術(shù)治療)。所有病人予以電話或門診隨訪，隨訪時(shí)間5～52個(gè)月，平均21.9個(gè)月(標(biāo)準(zhǔn)差12.3個(gè)月)。同時(shí)選擇正常大腸黏膜20例作為對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)S-P法測(cè)定手術(shù)標(biāo)本中癌組織及癌旁組織的P27kip1蛋白表達(dá)，在各步驟中嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。所有操作由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的2名病理科醫(yī)師進(jìn)行。P27kip1單抗購(gòu)自上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

P27kip1陽(yáng)性著色在細(xì)胞核、部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可表達(dá)。細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色染色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片均由2位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生在相同條件下觀察，每視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共1 000個(gè)細(xì)胞。P27kip1陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］:陽(yáng)性細(xì)胞占總計(jì)數(shù)細(xì)胞比例＜10%為陰性，＜50%為低表達(dá)(+)，≥50%為高表達(dá)(++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行P27蛋白的表達(dá)和臨床病理資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用Kaplan-meier進(jìn)行生存單因素分析，COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié)果

2.1 P27kip1在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá)

P27kip1陽(yáng)性著色在細(xì)胞核、部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可表達(dá)。162例結(jié)直腸癌的癌旁組織中P27kip1均有表達(dá)，其中高表達(dá)39例，高表達(dá)率為62.9%，而癌組織中P27kip1表達(dá)陽(yáng)性為43例，陽(yáng)性率為69%，高表達(dá)率為37%，兩組高表達(dá)率有明顯差異性(P=0.004)。但癌旁組織與正常組織中的P27kip1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.321)。見表1、圖1。

表1 P27kip1在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及正常組織的表達(dá)

2.2 P27kip1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

P27kip1的表達(dá)水平與年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分化無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P＞0.05)，但與腫瘤的臨床病理分期(TNM分期法)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)聯(lián)，腫瘤病理分期越晚，P27kip1的表達(dá)越弱;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例的癌組織中P27kip1的表達(dá)也較低(表2)。

表2 P27kip1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 生存分析

在接受根治性手術(shù)的62例患者中，P27kip1高表達(dá)的患者共20例，隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)及死亡的3例，低表達(dá)的38例，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的15例，P27kip1高表達(dá)病人的腫瘤復(fù)發(fā)率和死亡率均顯著低于P27kip1低表達(dá)者(P=0.044)。

通過(guò)Kaplan-meier檢驗(yàn)對(duì)P27kip1進(jìn)行生存單因素分析，提示P27kip1高表達(dá)的病人生存時(shí)間較長(zhǎng)(P=0.035)，然而通過(guò)COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析，沒(méi)能提示P27kip1的表達(dá)能作為獨(dú)立預(yù)測(cè)生存的因素(P＞0.05)，見圖2。

3 討論

P27kip1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)定活化細(xì)胞周期素依賴性激酶所需的細(xì)胞周期素E的閾值來(lái)抑制細(xì)胞增生［4-5］。P27kip1目前被公認(rèn)為是一種抑癌基因，其編碼的P27kip1蛋白具有限制性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程作用，這一作用主要是通過(guò)抑制cyclin-CDK復(fù)合物功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，P27kip1雖然可抑制各種cyclin-CDK復(fù)合物蛋白激酶活性，但在體內(nèi)，P27kip1主要與cyclinD1、CDK4以及cyclin E-CDK 2復(fù)合物結(jié)合，將細(xì)胞阻斷于G1期，使之不能進(jìn)入s期。越來(lái)越多的研究表明幾乎所有人類腫瘤均伴隨P27kip1下調(diào)或缺失［6］。Anderson等的研究表明，P27kip1基因表達(dá)與腫瘤的分化程度以及腫瘤的TNM分期有關(guān)，P27kip1的表達(dá)水平高低還影響腫瘤的浸潤(rùn)程度及腫瘤細(xì)胞的凋亡［7］。Tsukamoto等［8］在 16 個(gè) NSCIC 的切除后標(biāo)本中檢測(cè)P27kip1表達(dá)水平，并進(jìn)行追蹤調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P27kip1低表達(dá)者5年存活率為35.4%，明顯低于高表達(dá)者的63.2% ，可以看出，對(duì)于已行外科手術(shù)切除的NSCLC患者，癌組織的P27kip1表達(dá)水平可以作為預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，P27kip1的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、病理分化，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異，在腫瘤的分期及淋巴轉(zhuǎn)移上有顯著相關(guān)性，腫瘤分期越晚，P27kip1的表達(dá)越低，提示可能通過(guò)對(duì)P27kip1的檢測(cè)，來(lái)判斷患者的預(yù)后情況［9］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，P27與腫瘤的發(fā)展機(jī)制可能與Skp2-P27kip1通路有關(guān)，P27作為Skp2(S-phase associated kinase protein2)作用的底物與Skp2一起在許多惡性腫瘤中表達(dá)異常，Skp2可降解P27，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展［10］;另外，P27kip1中存在多種單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點(diǎn)，其中位于外顯子編碼區(qū)的Vall09Gly多態(tài)性為有義突變。P27Val109Gly基因多態(tài)性較純合性P27更易降解，細(xì)胞內(nèi)P27的含量便急劇下降。細(xì)胞內(nèi)P27含量減少使細(xì)胞周期G1期到s期過(guò)渡失控，從而引起或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［11］。

在生存分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，P27kip1高表達(dá)組的生存時(shí)間要長(zhǎng)于低表達(dá)組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行多因素分析的結(jié)果提示P27kip1不能作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，這與Claudio等［12］的研究結(jié)果并不一致。結(jié)合臨床考慮，所有術(shù)后的病人均有接受不同程度的放化療及中醫(yī)中藥治療，這些治療均可能延緩病人的生存期，因此可能干擾了本研究的研究結(jié)果。我們反思，自身研究的臨床要素并不一定是能夠?qū)︻A(yù)后評(píng)價(jià)作出一錘定音的評(píng)價(jià)效應(yīng)，若能反應(yīng)部分的生物效應(yīng)對(duì)臨床研究亦有益處，而對(duì)于腫瘤疾病的發(fā)展，也應(yīng)該是由多重因素相互制約協(xié)同的結(jié)果，更多的認(rèn)識(shí)，應(yīng)該通過(guò)更多的研究和臨床循證來(lái)證明，此外，樣本量及隨訪時(shí)間不夠，也可能是制約實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素。

我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈直線上升趨勢(shì)，作為早期手術(shù)治療療效較為滿意的一類腫瘤疾病，對(duì)于疾病預(yù)后往往成為病患及醫(yī)務(wù)工作者的關(guān)注重點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中的P27kip1蛋白表達(dá)水平可以較為合理的評(píng)估病人病情及預(yù)后，并有助于臨床篩選高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能的病人，目前已有研究表明對(duì)P27kip1基因修飾后可抑制腸道的腫瘤生長(zhǎng)［13］，相信不久的將來(lái)，對(duì)于結(jié)腸癌的基因治療，P27kip1將作為有效分子參與其中。

［1］ Palmqvist R，Stenling R，Oberg A，et al.Prognostic significance of P27kip1 expression in colorectal cancer:a clinic pathological characterization［J］.J Pathol，1999，188(1):18-23

［2］ Jun Chen，Guangxin Lu.Influence of human mutant p27 gene on the biological behaviors of colon cancer cells［J］.Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2009，8(1):21-23

［3］ Xiangming C，Natsugoe S，Takao S，et al.The cooperative role of p27 with cyclinE in the Prognosis of advanced gastric carcinoma［J］.Cancer，2000，89(6):1214-1219

［4］ Tigli H，Buyru N，Dalay N.Molecular analysis of the p27/kip1 gene in breast cancer［J］.Mol Diagn，2005，9(1):17-21

［5］ Li Q，Murphy M，Ross J，et al.Skp2 and p27kip1 expression in melanocytic nevi and melanoma:an inverse relationship［J］.J Cutan Pathol，2004，31(10):633-642

［6］ Galizia G，F(xiàn)erraraccio F，Lieto E，et al.p27 Downregulation and metallothionein overexpression in gastric cancer patients are associated with a poor survival rate［J］.J Surg Oncol，2006，93(3):241-252

［7］ Anderson J，Reddy VB，Green L，et al.Role of expression of cell cycle inhibitor P27 and MIB-1 in predicting lymph node metastasis in male breast cancinoma［J］.Breast J，2002，8(2):101-107

［8］ Tsukamoto S，Sugio K，Sakada T，et al.Reducde expression of cell cycle regulator p27(kip1)correlates with a shortened survival in nonsmall cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2001，34(1):83-90

［9］ Galizia G，Lieto E，F(xiàn)erraraccio F，et al.Determination of molecular marker expression can predict clinical outcome in colon carcinomas［J］.Clin Cancer Res，2004，10(10):3490-3499

［10］張 斌，趙 剛.Skp2-P27kip1通路與惡性腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.肝膽胰外科雜志，2012，24(2):166-168

［11］韋 鳳.p27Val109Gly基因多態(tài)性在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(9):845-847

［12］ Claudio PP，Russo G，Kumar CA，et al.pRb2/p130，vascularendothelial growth factor，p27(KIP1)，and proliferating cellnuclear antigen expression in hepatocellular carcinoma:theirclinical significance［J］.Clin Cancer Res，2004，10(10):3509-3517

［13］陳 珺，徐少勇.人突變p27基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響［J］.中國(guó)病理生理雜志，2007，23(10):2039-2041