葉滿軍，柳宏志，石 晶

（1.大慶油田總醫(yī)院 口腔外科，黑龍江 大慶163001；2.佳木斯大學(xué)研究生院 口腔臨床醫(yī)學(xué)系）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率高，約占口腔頜面部惡性腫瘤的80%以上。其腫瘤的發(fā)生、增殖、分化、轉(zhuǎn)移都需要大量能量的支持，而葡萄糖是腫瘤的主要能量來源。早在上世紀(jì)30年代，Warburg發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞需要攝取更多的葡萄糖，并且采取糖酵解的方式。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT－1）是葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)散的最主要蛋白之一，負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)糖代謝要求。在許多腫瘤攝取葡萄的過程中，GLUT－1發(fā)揮著重要作用。本研究利用免疫組織化學(xué)和RT－PCR法檢測口腔鱗癌組織中GLUT－1的蛋白和mRNA的表達(dá)情況，探討GLUT－1在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取2008年9月至2011年10月大慶油田總醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的53例OSCC組織和20例正?？谇徽衬そM織（距腫瘤邊緣＞3cm），所有口腔癌患者術(shù)前均未經(jīng)化療和放療，所有標(biāo)本均經(jīng)石蠟切片病理確診。標(biāo)本切取后迅速置于液氮或低溫冰箱內(nèi)冷凍。53例標(biāo)本中進(jìn)行如下分類：病理分級：Ⅰ級22例，Ⅱ級18例，Ⅲ級13例；采用國際抗癌協(xié)會（UICC）TMN分類標(biāo)準(zhǔn)（2002），臨床TNM 分期：T1～T2期33例，T3～T4期20例；男性44例，女性9例；年齡小于50歲14人，年齡大于50歲39人；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例。

1.1.2 主要試劑 GLUT 1兔抗人多克隆抗體（北京中山生物技術(shù)有限公司），免疫組化SP－9001染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），DAB顯色試劑盒 （福州邁新生物試劑公司），過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），OneStep RT－PCR試劑盒購自：德國凱杰生物技術(shù)（上海）有限公司，GLUT 1基因和內(nèi)參照引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)ABC法 取標(biāo)本的癌灶、正常組織的石蠟切片4張行蘇木精－伊紅及免疫組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)采用SABC法，主要步驟按說明書進(jìn)行，檸檬酸微波抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性塑膠封片，每組切片均以PBS代替一抗為陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 結(jié)果判定細(xì)胞膜連續(xù)出現(xiàn)棕黃色為Glut－1的陽性表達(dá)，隨機(jī)選擇5個高倍鏡視野（＊200），計(jì)數(shù)1000個腫瘤細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，＜10%為（－），＞10%為（＋）。

1.2.3 RT－PCR 用 Trizol提取總 RNA，1%瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳鑒別RNA的完整性，紫外分光光度法檢測RNA的純度及濃度；以β－肌動蛋白為內(nèi)參，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，具體操作按照試劑盒說明進(jìn)行。GLUT 1引物序列：上游：5′CGGGCCAAGAGTGTACTAAA3′ 下 游： 5′TGACGATACCGGAGCCAATG3′，擴(kuò)增片段283 bp，β－肌動蛋白引物序列：上游：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′下 游：5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，擴(kuò)增片段513bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化部分

2.1.1 Glut－1蛋白在口腔鱗狀細(xì)胞癌和正?？谇火つそM織中的表達(dá)（見表1）Glut－1蛋白在正常粘膜下未見陽性染色，Glut－1均不表達(dá)。Glut－1在癌組織中陽性染色位于細(xì)胞膜，為棕黃色顆粒，呈灶性或彌散性分布，細(xì)胞染色深度不等，遠(yuǎn)離血供區(qū)癌細(xì)胞染色深。53例癌組織和20例正常組織標(biāo)本中，Glut－1在癌組織和正常組織中表達(dá)率分別為62.26%、0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝22.726，P＝0.000）。

2.1.2 Glut－1蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（見表1）Glut－1蛋白在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同臨床分型患者間的表達(dá)陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明 Glut－1蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。

Glut－1蛋白在不同組織學(xué)類型、不同年齡、不同性別患者間的陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明Glut－1蛋白的表達(dá)與病理分型、年齡、性別無明顯相關(guān)性。

2.2 PCR部分

2.2.1 Glut－1mRNA在口腔鱗狀細(xì)胞癌和正?？谇火つそM織中的表達(dá)（見圖1、圖2）PCR產(chǎn)物電泳顯示，Glut－1條帶位于283bp處，內(nèi)參位于513 bp處，與設(shè)計(jì)完全吻合，癌組織與正常組織相比較，Glut－1的條帶亮度差異十分明顯。53例癌組織和20例正常組織標(biāo)本中，Glut－1mRNA在癌組織和正常組織中表達(dá)率分別為81.13%、5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝35.149，P＝0.000）。

圖1 1DNA Marker 2陰性對照3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性（中分化口腔鱗癌）4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性（低分化口腔鱗癌）5淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性（高分化口腔鱗癌）6正?？谇火つ?/p>

圖2 1DNA Marker 2正?？谇火つ?高分化口腔鱗癌4中分化口腔鱗癌5低分化口腔鱗癌6對照

2.2.2 Glut－1mRNA的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（見表1）Glut－1mRNA在不同組織學(xué)類型、不同臨床分型、有無淋巴轉(zhuǎn)移的表達(dá)陽性率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明Glut－1mRNA的表達(dá)與病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。

Glut－1mRNA在不同年齡、不同性別患者陽性表達(dá)率間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明Glut－1mRNA的表達(dá)與年齡、性別無明顯相關(guān)性。

2.3 Glut－1蛋白水平的表達(dá)與mRNA水平表達(dá)的比較

總體上，mRNA的檢測較免疫組化的蛋白檢測敏感性高，兩種方法的結(jié)果與臨床病理的關(guān)系基本一致，癌組織陽性表達(dá)率高于正常組織，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與年齡、性別無關(guān)。而在組織學(xué)類型方面，免疫組化結(jié)果比較無明顯差異，而RTPCR結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

研究表明，目前的多克隆抗體免疫組化技術(shù)，在人類正常上皮及良性上皮腫瘤組織中未能檢測到Glut－1蛋白的表達(dá)，可能因?yàn)镚lut－1蛋白表達(dá)水平較低，而免疫組化方法檢測不夠靈敏，并且Glut－1蛋白易降解。但大量研究表明，Glut－1蛋白在惡性腫瘤中呈普遍高表達(dá)陽性率達(dá)到或超過50%。Yen等［1］在研究宮頸癌中研究顯示，94%的癌癥患者都有Glut－1過表達(dá)，在正常細(xì)胞基底層和宮頸上皮良性病變組織中沒有表達(dá)或微弱表達(dá)；在復(fù)發(fā)性和持續(xù)性腫瘤中，腫瘤大小與Glut－1呈正相關(guān)性。楊井等［2］研究顯示Glut－1在惡性黑色素組織中表達(dá)明顯上升，且與色素痣比較差異有顯著性意義，提示惡性黑色素瘤的糖的吸收和利用增加，Glut－1有可能作為判斷腫瘤的標(biāo)記物之一。Kurata等［3］采用定量PCR技術(shù)檢測35例原發(fā)性肺癌患者病變組織發(fā)現(xiàn)，周圍正常肺組織的肝轉(zhuǎn)移性肺腫瘤和正常肺組織比較顯示，Glut－1mRNA在原發(fā)肺腫瘤中的表達(dá)顯著高于正常肺組織。對67例軟組織、骨惡性腫瘤患者隨訪，采用 KaPlan－Meier生存分析法顯示，Glut－1在軟組織、骨惡性腫瘤中過度表達(dá)，表達(dá)程度與腫瘤的轉(zhuǎn)移、患者的生存率具有相關(guān)性［4］。Zhou等［5］檢測了38例頭頸部惡性腫瘤中Glut－1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示Glut－1的基因和蛋白水平均顯著高于癌旁組織和正常組織。

表1 GLUT1蛋白及mRNA在口腔鱗癌中的表達(dá)和臨床病理特征的關(guān)系

本研究顯示，在正常口腔粘膜組織中Glut－1蛋白不表達(dá)，Glut－1mRNA低表達(dá)（5%），口腔鱗癌中Glut－1的蛋白和mRNA陽性表達(dá)率分別為62.26%和81.13%，，明顯高于正常粘膜組織，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.這與 Kunkei等［6］應(yīng)用免疫組化技術(shù)研究118例口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)現(xiàn)Glut－1蛋白呈高表達(dá)的結(jié)果一致。同樣Noguchi等［7］用逆轉(zhuǎn)錄方法檢測胃癌組織中Glut－1mRNA的表達(dá)陽性率為95%，也支持上述結(jié)果。提示在口腔鱗癌的發(fā)生過程中，Glut－1的過度表達(dá)與口腔黏膜上皮細(xì)胞的異常增殖相互促進(jìn)，在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中可能起到重要作用。

Glut－1蛋白和mRNA異常表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性。此次實(shí)驗(yàn)顯示Glut－1蛋白在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的陽性表達(dá)率分別為54.21%、50.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.071，P＝0.014）.Glut－1蛋白在Ⅲ＋Ⅳ期患者和Ⅰ＋Ⅱ期患者中的表達(dá)陽性率分別為80.00%、51.52%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.300，P＝0.038）。Glut－1mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中的陽性表達(dá)率分別為100%、70.59%，差 異 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （χ2＝6.888，P＝0.009）.Glut－1mRNA 在Ⅲ＋Ⅳ期患者和Ⅰ＋Ⅱ期患者中的表達(dá)陽性率分別為95.00%、72.23%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.036，P＝0.045）。Kato等［8］曾用免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，Glut－1的表達(dá)程度與食管癌的腫瘤細(xì)胞的浸潤程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。Jonathan等［9］研究結(jié)果同樣顯示Glut－1表達(dá)強(qiáng)度越高，患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，總生存率越低。蔣建國等［10］研究Glut－1蛋白和基因在人喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義中得出，Glut－1的表達(dá)情況與腫瘤的組織學(xué)類型、臨床病理分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等病理學(xué)特征密切相關(guān)。均支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。提示可能III、IV期癌細(xì)胞相比較I、II期而言增殖、生長速度更快，能量需求更高，所以Glut－1的表達(dá)率更高，同樣，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，對能量的需求高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞。說明Glut－1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)，且隨著Glut－1的表達(dá)增加癌細(xì)胞的生物學(xué)行為更差，預(yù)后不良。

Glut－1蛋白和Glut－1mRNA的異常表達(dá)與癌組織分化程度的關(guān)聯(lián)性存在差異，本實(shí)驗(yàn)顯示口腔鱗癌組織中Glut－1蛋白的表達(dá)在高分化中為54.55%、中分化為55.56%、低分化為84.62%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？谇击[癌組織中Glut－1mRNA的表達(dá)在高分化中為63.44%、中分化為88.89%、低分化為100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這可能與免疫組化自身不可避免的誤差，存在假陽性和假陰性的可能，而RT－PCR實(shí)驗(yàn)過程中同樣存在假基因干擾、外源基因污染、RNA的非法轉(zhuǎn)錄等客觀因素，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。目前研究結(jié)果顯示Glut－1異常表達(dá)與組織學(xué)的關(guān)系尚無定論。例如Aiopi等［11］發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Glut－1陽性率呈高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度與與病理分級正相關(guān)。Km等［12］在研究直腸癌組織中發(fā)現(xiàn)Glut－1的表達(dá)與病理分級呈正相關(guān)性，高核分裂像組織中Glut－1表達(dá)強(qiáng)度明顯高于低分裂像組織。張鵬飛等［13］在研究胃癌中Glut－1的表達(dá)時同樣認(rèn)為Glut－1的表達(dá)同病理分級呈正相關(guān)性。但也有不同意見，鄒積艷等［14］在研究卵巢癌中Glut－1表示是發(fā)現(xiàn)Glut－1的高表達(dá)與組織學(xué)分級無相關(guān)性。裘正軍等［15］在研究胰腺癌、許樂等［16］在研究腎癌組織中的Glut－1表達(dá)均得出同樣結(jié)論。Glut－1的表達(dá)與組織分型的關(guān)系在不同腫瘤中表現(xiàn)出的差異性，可能是由于在不同性質(zhì)中的腫瘤中Glut－1的調(diào)控機(jī)制并不完全相同。Glut－1在腫瘤細(xì)胞的表達(dá)與多種因素有關(guān)，受內(nèi)在和外在的信號調(diào)控，并且一種腫瘤可以表達(dá)一種或幾種Glut，在腫瘤的能量代謝方面發(fā)揮不同的作用。因此，Glut－1在不同腫瘤中的表達(dá)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Glut－1在大多數(shù)惡性腫瘤中高表達(dá)對腫瘤的診斷和治療具有重要意義。通過檢測Glut－1在腫瘤中的表達(dá)，可以為腫瘤的早期判斷提供有效地幫助。目前以Glut－1為靶點(diǎn)降低葡萄糖的攝取，從而阻斷腫瘤的能量供應(yīng)來治療腫瘤的方法已經(jīng)悄然興起。目前仍需進(jìn)一步研究Glut－1在各種不同組織中各自表達(dá)和調(diào)節(jié)作用、以及Glut－1在不同組織中的運(yùn)輸過程，這將為惡性腫瘤的診斷、預(yù)后、治療提供可靠的理論依據(jù)。

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