徐麗君 湯杰印 張祥貴 馬華林

商陸皂苷甲(Esculentoside A，EsA)是從中草藥商陸塊根中提純的一種三萜類(lèi)皂苷，已被證實(shí)有顯著調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抑制細(xì)胞增殖和促凋亡的作用[1-5]，在自身免疫性腎炎動(dòng)物模型中顯示良好的治療效果[6-7]。本實(shí)驗(yàn)選用大鼠腎小球系膜細(xì)胞(rGMC)為對(duì)象，觀察EsA對(duì)體外培養(yǎng)的rGMC增殖影響及促凋亡情況，并探討其作用機(jī)制，為其治療慢性腎臟病提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料 rGMC株(HBZY-1)由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供；EsA購(gòu)自上海同田公司，批號(hào)：10072431，白色粉劑(不溶于水)，于實(shí)驗(yàn)前溶于0.1%DMSO溶液中；白細(xì)胞介素1 β（IL-1 β）購(gòu)自Prospec公司，生產(chǎn)批號(hào)：#407 IL 1 B 01；MTT、DMSO、胰酶均購(gòu)自Sigma公司，MEM培養(yǎng)液購(gòu)自Genom公司，優(yōu)級(jí)胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，兔抗大鼠Caspase-3 (武漢博士德公司)，Actin單克隆抗體(SantaCruz)，HRP標(biāo)記山羊抗兔(KPL)，PVDF Western轉(zhuǎn)印膜(Millipore)，流式細(xì)胞儀(FACS Vantage DiVa，BD)，酶標(biāo)儀(ELX 800)為Bio-Tek Instruments INK(美國(guó))公司。

1.2 方法

1.2.1 rGMC培養(yǎng) rGM購(gòu)回后于倒置顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，鋪滿瓶底，培養(yǎng)液透明清亮，適應(yīng)性培養(yǎng)4 h后吸取全部培養(yǎng)液（5% FBS的MEM）入無(wú)菌瓶?jī)?nèi)，并將FBS濃度由5%調(diào)整為10%做GMC培養(yǎng)備用。用PBS液洗細(xì)胞2 次，加入胰酶（含0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA和酚紅）消化細(xì)胞，見(jiàn)細(xì)胞變圓，呈片狀脫落時(shí)，加入10% FCS的MEM，終止消化，將細(xì)胞懸液移入離心管中，800 r/min，4 min離心后，棄去上清液，加入3 mL 10%FCS的MEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按1∶3 接種于25 mm培養(yǎng)瓶，每瓶加入10%FBS的MEM培養(yǎng)液至5 mL，吹打均勻，放入37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液2 d/次，細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，3 d傳1 次代。本實(shí)驗(yàn)采用6～9 代rGMC。

1.2.2 分組 在檢測(cè)EsA對(duì)rGMC的增殖影響中，我們根據(jù)EsA濃度分為對(duì)照組及20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L共七組，并檢測(cè)24 h、48 h及72 h各組OD值；對(duì)Caspase-3 表達(dá)影響中，分為對(duì)照組及IL-1 β組與IL-1 β+EsA組共三組。

1.2.3 MTT法測(cè)定EsA對(duì)rGMC增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期rGMC接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)箱中孵育24 h后使rGMC同生長(zhǎng)于G0 期。對(duì)照組加入10%FBS的MEM培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組除加入上述培養(yǎng)液外，還分別加入終濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/L用DMSO溶解的EsA，上述各組分別培養(yǎng)至24 h，48 h及72 h時(shí)，換新鮮培養(yǎng)液，按上述方法加入MTT培養(yǎng)4 h后，加入DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次。

1.2.4 WB法檢測(cè)Caspase-3 的表達(dá) 提取按上述方法接種、培養(yǎng)、分組作用48 h后各組細(xì)胞總蛋白，每組1×106個(gè)細(xì)胞，用Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并置于-2℃?zhèn)溆谩Ｃ總€(gè)樣品取30 μg蛋白質(zhì)加入5×SDS凝膠加樣緩沖液使其終濃度成為1×，100℃煮沸5 min，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠45 V 40 min，分離膠120 V 90 min)后，200 mA電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)至PVDF膜1 h，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入稀釋的Caspase-3 (1∶500)一抗和Actin單克隆抗體（1∶1000），室溫下孵育2 h，TBST洗膜，加1∶3000 TBST稀釋的二抗室溫孵育45 min，TBST洗膜，加入等體積混溶的A、B化學(xué)發(fā)光試劑，保持1.5 min，去盡殘夜，曝光成像。照片用GelDoc 2000 凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，確定雜交條帶的光密度值，用各組的光密度值/內(nèi)參照光密度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3～5 次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組資料間均數(shù)比較采用方差分析；多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較，方差齊者采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者用Tamhane'sT2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎小球系膜細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察 經(jīng)傳代后rGMC，24 h后幾乎全部伸展貼壁，生長(zhǎng)迅速，2～3 d鋪滿瓶底。在倒置顯微鏡下觀察，rGMC呈梭形、不規(guī)則形、紡錘形、胞核居細(xì)胞中央呈卵圓狀，胞體多突起，生長(zhǎng)密集時(shí)，細(xì)胞接觸間隙可消失。見(jiàn)圖1。

圖1a:正常培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)(×40 倍)

圖1b:正常培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞形態(tài)(×200 倍）

2.2 EsA對(duì)rGMC的增殖影響 與對(duì)照組比較，EsA（2.5～5 mg/L）在48、72 h明顯抑制了細(xì)胞的增殖(P＜0.05 或P＜0.01)，見(jiàn)表1。

表1 EsA對(duì)rGMC增殖作用的OD值（±s）

表1 EsA對(duì)rGMC增殖作用的OD值（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

組別 n OD(24 h) OD(48 h) OD(72 h)對(duì)照組 6 0.529±0.081 0.808±0.021 1.331±0.219 EsA(20 mg/L) 6 0.547±0.362 0.863±0.903 1.218±0.165 EsA(10 mg/L) 6 0.547±0.097 0.880±0.080 1.330±0.146 EsA(5 mg/L) 6 0.508±0.018 0.642±0.060 a 0.966±0.325 a EsA(2.5 mg/L) 6 0.478±0.043 0.716±0.081 b 1.032±0.123 b EsA(1.25 mg/L) 6 0.479±0.026 0.815±0.056 1.271±0.185 EsA(0.625 mg/L) 6 0.473±0.053 0.805±0.041 1.232±0.218

2.3 EsA對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)rGMC的Caspase-3 表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，IL-1 β組與IL-1 β+EsA組Caspase-3 表達(dá)均明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；與IL-1 β組比較，EsA+IL-1 β組Caspase-3 的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞的Caspase-3 的表達(dá)

3 討論

EsA是從中國(guó)商陸塊根中提純而得到的一種三萜類(lèi)皂苷化合物，既往研究顯示其具有顯著的抑制血清中炎性細(xì)胞因子(如IL-1、TNFα、IL-6、PAF及活性氮等)的產(chǎn)生及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，具有抑制人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，而改善銀屑病病情等作用[5]。研究顯示EsA具有抗炎、抑制細(xì)胞增殖和促凋亡的作用[8]。

rGMC是腎小球固有細(xì)胞之一，正常情況下，幾乎不增殖，炎癥狀態(tài)下，可被活化而異常增殖，引起細(xì)胞外基質(zhì)(EMC)增加，降解減少，并釋放各種生物活性物質(zhì)（如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、反應(yīng)性氧族等）趨化單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞進(jìn)入病灶，使其釋放炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步活化GMC，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致腎小球硬化及終末期腎臟病。由于GMC增殖是狼瘡性腎炎(LN)等多種腎小球疾病的共同病理表現(xiàn)，抑制GMC增殖對(duì)防治系膜細(xì)胞增殖性腎小球疾病有重要的臨床意義，并已成為研究的熱點(diǎn)。為明確EsA在LN等系膜細(xì)胞增殖性腎炎腎組織中的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，同時(shí)考慮IL-1 β是刺激GMC活化的主要炎癥因子，其在腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展中的典型性，故本實(shí)驗(yàn)選用了IL-1 β作為誘導(dǎo)因子，建立了體外IL-1 β誘導(dǎo)GMC增殖的模型。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EsA(2.5～5 mg/L)對(duì)血清誘導(dǎo)的rGMC增殖48～72 h有顯著的抑制作用，IL-1 β誘導(dǎo)GMC增殖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9]。細(xì)胞增殖的實(shí)質(zhì)是促進(jìn)與抑制，增殖與凋亡的失衡[10]。細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞的最終命運(yùn)是在細(xì)胞周期水平由共同的調(diào)控者——細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白決定的[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 β促進(jìn)了GMC增殖的同時(shí)，也出現(xiàn)了Caspase-3 的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞細(xì)胞凋亡率明顯增加，說(shuō)明細(xì)胞周期啟動(dòng)后凋亡敏感性增加，細(xì)胞處于功能活躍階段易于凋亡[12]，即激活誘導(dǎo)性細(xì)胞凋亡(AICD)，進(jìn)一步說(shuō)明了細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的協(xié)調(diào)（CAP）。同時(shí)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡處于早期，未檢測(cè)到晚期細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死的凋亡峰，可能與實(shí)驗(yàn)中時(shí)間的點(diǎn)選擇有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中EsA對(duì)IL-1 β誘導(dǎo)的rGMC的細(xì)胞增殖中表現(xiàn)的凋亡并無(wú)促進(jìn)作用，提示體外EsA作用于IL-1 β誘導(dǎo)的rGMC無(wú)促進(jìn)凋亡作用，而其在體內(nèi)的促進(jìn)腎組織凋亡的作用，可能是EsA對(duì)GMC的凋亡無(wú)促進(jìn)作用，而是促進(jìn)了腎臟其他組織的凋亡，也可能是EsA通過(guò)影響多重細(xì)胞因子的分泌，調(diào)整了體內(nèi)Th1/Th2的細(xì)胞因子平衡，或是通過(guò)體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生其他生物活性物質(zhì)而促進(jìn)了GMC等腎組織的凋亡，IL-1 β也可能會(huì)對(duì)不同的細(xì)胞或者細(xì)胞在不同的環(huán)境誘導(dǎo)中表現(xiàn)出凋亡或增殖為主的現(xiàn)象，需行進(jìn)一步研究以證實(shí)。

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