劉慧莉，趙剛

·基礎(chǔ)研究·

小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β的影響①

劉慧莉，趙剛

目的 觀察小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)蛋白及基因表達(dá)的影響。方法3月齡雌性C57BL/6J小鼠24只，分為運(yùn)動組(n=12)與對照組(n=12)。5個月后行Morris水迷宮測試及GSK-3β檢測。結(jié)果運(yùn)動組小鼠逃避潛伏期短于對照組(P＜0.05)，尋找平臺路徑長度短于對照組(P＜0.05)，穿環(huán)次數(shù)多于對照組(P＜0.05)；運(yùn)動組小鼠GSK-3β mRNA表達(dá)水平低于對照組(P＜0.05)，p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動可提高小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，降低GSK-3β活性可能是其健腦作用的分子機(jī)制之一。

跑臺運(yùn)動；空間學(xué)習(xí)記憶功能；糖原合成酶激酶-3β；小鼠

[本文著錄格式]劉慧莉，趙剛.小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對小鼠空間學(xué)習(xí)記憶及海馬糖原合成酶激酶-3β的影響[J].中國康復(fù)理論與實踐,2013,19(11):1016-1019.

運(yùn)動作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)有效的刺激形式，能夠促進(jìn)大腦的功能重組和代償。眾多研究表明，規(guī)律運(yùn)動能提高認(rèn)知功能[1-4]。運(yùn)動形式是影響運(yùn)動效果的重要因素之一。嚙齒類動物實驗研究中最常采用的運(yùn)動形式為跑臺運(yùn)動及跑輪運(yùn)動，跑臺運(yùn)動作為一種被動運(yùn)動形式，能準(zhǔn)確限定運(yùn)動強(qiáng)度、時間、頻度，更接近于人類運(yùn)動處方的執(zhí)行模式。

糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是參與糖代謝的主要限速酶之一，可使糖原合成酶磷酸化而抑制糖原合成。除參與糖代謝調(diào)節(jié)外，GSK-3還參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等。GSK-3主要有兩種亞型：GSK-3α和GSK-3β。GSK-3β在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達(dá)，特別在海馬表達(dá)水平更高[5]。研究顯示，GSK-3β參與海馬突觸可塑性的調(diào)節(jié)[6-7]。海馬中GSK-3β的激活與記憶的形成相關(guān)[8]。

本研究觀察小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動對C57BL/6J小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織中GSK-3β蛋白表達(dá)及基因表達(dá)的影響，為制定運(yùn)動處方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 3月齡雌性C57BL/6J小鼠24只，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由進(jìn)食和飲水。每天光照12 h。飼養(yǎng)室溫度22～24℃，相對濕度40%～60%。實驗動物飼養(yǎng)及取材遵守實驗動物管理和保護(hù)的有關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要藥品及試劑 兔抗GSK-3β抗體、羊抗p-GSK-3β(Ser9)抗體：美國SANTA CRUZ BIOTECH-NOLOGY公司；實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)試劑盒：SYBR Premix Ex TaqTM，Ta-KaRa大連寶生物工程有限公司；RT-PCR引物由Ta-KaRa大連寶生物工程有限公司設(shè)計合成。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 小動物跑臺、Morris水迷宮：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；超速低溫離心機(jī)：德國Heraus-Biofuge-Primo?；UV-260紫外分光光度計：日本島津公司；電泳儀、轉(zhuǎn)印槽：上海天能科技有限公司；BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；LightCycler 48ⅡPCR儀：瑞士Roche公司。

1.2 實驗方法

小鼠分為對照組和運(yùn)動組，每組12只。

運(yùn)動組進(jìn)行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練2 d，第1天5 m/min運(yùn)動10 min，第2天8 m/min運(yùn)動10 min。第3天開始正式運(yùn)動，每天14:00后進(jìn)行跑臺運(yùn)動30 min：5 m/ min運(yùn)動5 min，8 m/min運(yùn)動5 min，11 m/min運(yùn)動20 min。這一運(yùn)動強(qiáng)度約為45%～55%最大攝氧量(VO2max)[9]。

每天運(yùn)動結(jié)束后放回飼養(yǎng)籠中，自由進(jìn)食飲水。每周運(yùn)動5 d，休息2 d，持續(xù)5個月(從3月齡至8月齡)。所有動物均順利完成運(yùn)動方案。

對照組置于靜止跑臺上，與運(yùn)動組時間相同。

1.3 Morris水迷宮測試

5個月運(yùn)動訓(xùn)練后進(jìn)行Morris水迷宮測試[10]。Morris水迷宮由圓形水池(直徑120 cm，高60 cm)、站臺(直徑8 cm)、影像追蹤系統(tǒng)構(gòu)成，水深約30 cm，水中加入無毒的食用白色素，使池水渾濁呈乳白色，水溫維持在24℃。池壁標(biāo)明“E、S、W、N”4個入水點，將水池等分為4個象限，平臺置于第Ⅳ象限中央。水池上方攝像頭與計算機(jī)相連，用ZH0065 Plus Image Analyzer記錄實驗過程中小鼠的運(yùn)動行為。正式實驗開始前1 d，予小鼠適應(yīng)性游泳訓(xùn)練。

整個實驗過程分為定位航行實驗和空間探索實驗。定位航行實驗包括可視平臺實驗1 d和隱蔽平臺實驗6 d，實驗過程中，平臺位置保持不變。最后一次隱蔽平臺實驗結(jié)束24 h后進(jìn)行空間探索實驗。

可視平臺實驗中，平臺超過水面0.5 cm，分別將小鼠從4個不同的入水點面向池壁投入水中，小鼠尋找平臺。當(dāng)小鼠爬上平臺或時間到達(dá)60 s時，停止實驗。如果60 s內(nèi)小鼠沒有找到平臺，則實驗者引導(dǎo)其爬到平臺上，并讓其停留10 s。

隱蔽平臺實驗中，平臺低于水面0.8 cm，每天分別從4個象限入水，隨機(jī)選取第1次入水的象限，連續(xù)6 d，方法與可視平臺實驗相同。每次間隔5～15 min。

通過影像跟蹤系統(tǒng)記錄小鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期(escape latency)和路程即路徑長度(path length)，并根據(jù)小鼠在水中搜索平臺的游泳軌跡確定其每次的搜索策略。

空間探索實驗時，撤去水中平臺，把小鼠從第Ⅱ象限投入水中，記錄120 s內(nèi)小鼠通過平臺位置的次數(shù)(cross times)和搜索平臺的游泳軌跡。

1.4 組織取材

Morris水迷宮實驗結(jié)束1周后取材。所有小鼠斷頭取腦，剝離海馬，一半海馬快速投入液氮速凍，-80℃冰箱保存，待行Western blotting檢測。另一半加入Trizol，-80℃冰箱保存，待行RT-PCR。

1.5 Western blotting

取冷凍的小鼠海馬組織稱重，小剪刀剪碎樣品(冰上操作)，1∶4加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4℃裂解過夜，4℃12000 r/min低溫離心30 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，每管50 μg蛋白分裝，-80℃凍存待用。

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品，4℃轉(zhuǎn)膜過夜，5%BSA溶液室溫封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光，凝膠圖像分析系統(tǒng)采圖、分析。

1.6 RT-PCR

總RNA提取：取出凍存的海馬組織，充分勻漿(冰上操作)，裂解組織細(xì)胞后，將勻漿液移至1.5 ml離心管中。加入氯仿200 μl，振蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4℃12000 r/min離心15 min，取上清；加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫孵育10 min，4℃12000 r/min離心10 min，棄上清；加入75%DEPC水配制的乙醇1 ml，輕輕洗滌管壁，4℃12000 r/min離心5 min，棄上清；室溫干燥，加入DEPC水50 μl，將沉淀溶解；吸取20 μl總RNA樣品，紫外分光光度計測260 nm及280 nm吸光度值，檢測提取RNA的質(zhì)量及產(chǎn)量。剩余樣品-80℃冰箱保存。

cDNA合成：取總RNA 1 μl，配置成cDNA合成反應(yīng)液10 μl(含5x PrimeScript Buffer 2 μl，Prime-Script RT Enzyme Mix I 0.5 μl，50 μmol/L Oligo dT Primer 0.5 μl，Random 6mer 0.5 μl，RNase free dH2O 5.5 μl)，37℃孵育15 min，85℃終止反應(yīng)5 s，4℃保持，-20℃長期保存。

PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系20 μl(SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μl，10 μmon/L PCR Forward Primer 0.8 μl，10 μmon/L PCR Reverse Primer 0.8 μl，cDNA溶液2 μl，dH2O 6.4 μl)，反應(yīng)條件：初始循環(huán)，95℃5 min；擴(kuò)增循環(huán)，95℃15 s，55℃15 s，72℃45 s，共40個循環(huán)；繪制溶解曲線：95℃15 s，60℃ 1 min，緩慢加熱到95℃15 s。

引物序列：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，熒光定量PCR儀自動分析并計算結(jié)果，實時RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，即PCR反應(yīng)指數(shù)增長初期熒光信號跨越閾值時的反應(yīng)循環(huán)數(shù)。相對定量采用比較Ct法：以β-actin基因為管家基因，ΔCt為目的基因和管家基因的Ct值差。ΔΔCt表示對照組與處理組間的ΔCt差異。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 隱蔽平臺實驗兩組逃避潛伏期

圖2 隱蔽平臺實驗兩組尋找平臺路徑長度

采用SAS 8.1統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較采用方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮

可視平臺實驗中，小鼠的逃避潛伏期對照組為(56.34±8.62)s，運(yùn)動組為(55.67±6.58)s，無顯著性差異(F=0.43,P=0.5134)；路徑長度對照組為(842.59± 138.16)cm，運(yùn)動組為(823.78±113.67)cm，無顯著性差異(F=1.25,P=0.2665)。

隱蔽平臺實驗中，兩組小鼠搜索平臺的逃避潛伏期和尋找平臺路徑長度均呈下降趨勢(圖1、圖2)。從第3天開始，運(yùn)動組逃避潛伏期顯著短于對照組(F= 21.54,P=0.0001)；從第4天開始，運(yùn)動組尋找平臺路徑長度顯著短于對照組(F=95.21,P=0.0001)。

空間探索實驗中，運(yùn)動組通過平臺位置(6.78± 1.88)次，明顯多于對照組(3.94±1.45)次(F=13.75,P= 0.0012)。

2.2 RT-PCR

溶解曲線只顯示一個主波峰，表明PCR擴(kuò)增的特異性較高，符合熒光定量PCR的技術(shù)要求。擴(kuò)增曲線分析顯示樣本擴(kuò)增效率良好。

運(yùn)動組GSK-3β mRNA表達(dá)的ΔΔCt為(0.5601± 0.2152)，明顯低于對照組(-0.0014±0.2352)(F=18.61,P=0.0015)。

2.3 Western blotting

運(yùn)動組p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值較對照組顯著升高(F=232.37,P=0.001)。見圖3。

圖3 兩組p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值

3 討論

跑臺訓(xùn)練常常使用電刺激等手段，被認(rèn)為是一種被動運(yùn)動形式，可能會引起訓(xùn)練動物的精神刺激，產(chǎn)生不良后果，因而很多實驗者采用主動運(yùn)動的跑輪進(jìn)行研究。但在實際制定運(yùn)動處方中，我們經(jīng)常需要限定運(yùn)動強(qiáng)度、運(yùn)動時間、運(yùn)動頻度等，來保證處方的安全性和有效性，這是跑輪運(yùn)動無法代替的。本實驗采用小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動，在整個訓(xùn)練過程中，小鼠輕松完成運(yùn)動方案，并未使用電刺激等強(qiáng)迫運(yùn)動手段。我們認(rèn)為這種運(yùn)動更接近人類的運(yùn)動處方形式。

本研究顯示，經(jīng)過5個月的小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動，小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)，與以往研究結(jié)果一致[1-4]。

作為GSK-3的一個亞型，GSK-3β在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都有表達(dá)。海馬中GSK-3β的激活與記憶的形成相關(guān)[8]。

GSK-3活性受多種機(jī)制調(diào)節(jié)，磷酸化是研究最多的調(diào)節(jié)方式之一。GSK-3β-Ser9和GSK-3β-Tyr216的磷酸化修飾是機(jī)體對GSK-3β活性調(diào)控的關(guān)鍵過程，磷酸化GSK-3β的Ser9可以導(dǎo)致其失活[12]。與之相反的是磷酸化GSK-3β的Thr216則能夠增加此酶的活性。我們利用p-GSK-3β-Ser9/GSK-3β比值反映GSK-3β的活性，p-GSK-3β-Ser 9/GSK-3β比值下降表示GSK-3β的活性升高[13]。

研究顯示，小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動抑制GSK-3β活性。實時定量RT-PCR結(jié)果也顯示，小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動使C57BL/6J小鼠GSK-3β mRNA表達(dá)水平降低。此前研究顯示，GSK-3β參與調(diào)控長期跑臺運(yùn)動對小鼠學(xué)習(xí)和記憶的影響[14]，與本研究一致。

本研究顯示，5個月小強(qiáng)度跑臺運(yùn)動能提高小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，同時伴有GSK-3β基因表達(dá)與蛋白表達(dá)降低。兩者之間可能存在一定聯(lián)系，需要進(jìn)一步研究。本實驗采用的運(yùn)動處方對于健腦運(yùn)動處方的制定有一定參考意義。

[1]徐波,黃濤,季瀏.跑臺訓(xùn)練增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)記憶及其海馬BDNF基因表達(dá)[J].北京體育大學(xué)學(xué)報,2011,34(4):51-53.

[2]Berchtold NC,Chinn G,Chou M,et al.Exercise primes a molecular memory for brain-derived neurotrophic factor protein induction in the rat hippocampus[J].Neuroscience,2005,133 (3):853-861.

[3]Van Praag H,Shubert T,Ahao C,et al.Exercise enhances learning and hippocampal neurogenesis in aged mice[J].J Neurosci,2005,25(38):8680-8685.

[4]Liu HL,Zhao G,Cai K,et al.Treadmill exercise prevents decline in spatial learning and memory in APP/PS1 transgenic mice through improvement of hippocampal long-term potentiation[J].Behav Brain Res,2011,218(2):308-314.

[5]Leroy K,Brion JP.Developmental expression and localization of glycogen synthase kinase-3 beta in rat brain[J].J Chem Neuroanat,1999,16(4):279-293.

[6]Hooper C,Markevich V,Plattner F,et al.Glycogen synthase kinase-3 inhibition is integral to long-term potentiation[J].Eur J Neurosci,2007,25(1):81-86.

[7]Peineau S,Taghibiglou C,Bradley C,et al.LTP inhibits LTD in the hippocampus via regulation of GSK3β[J].Neuron,2007, 53(5):703-717.

[8]Hong JG,Kim DH,Lee CH,et al.GSK-3β activity in the hippocampus is required for memory retrieval[J].Neurobiol Learn Mem,2012,98(2):122-129.

[9]Baker EJ,Gleeson TT.The effects of intensity on the energetics of brief locomotor activity[J].J Exp Biol,1999,202(Pt 22): 3081-3087.

[10]van Praag H,Christie BR,Sejnowski TJ,et al.Running enhances neurogenesis,learning,and long-term potentiation in mice[J].Proc NatlAcad Sci USA,1999,96(23):13427-13431. [11]Yuan JS,Reed A,Chen F,et al.Statistical analysis of real-time PCR data[J].BMC Bioinformatics,2006,7:85.

[12]Cole AR,Knebel A,Morrice NA,et al.phosphorylation of the Alzheimer epitope within collapsing response mediator proteins regulates axon elongation in primary neurons[J].J Biol Chem,2004,279(48):50176-50180.

[13]de la Monte SM,Tong M,Lester-Coll N,et al.Therapeutic rescue of neurodegeneration in experimental type 3 diabetes: Relevance to Alzheimer's disease[J].J Alzheimers Dis,2006, 10(1):89-109.

[14]Bayod S,del Valle J,Canudas AM,et al.Long-term treadmill exercise induces neuroprotective molecular changes in rat brain[J].JAppl Physiol,2011,111(5):1380-1390.

Effects of Low Intensity Treadmill Training on Spatial Learning and Memory and Expression of Glycogen Synthase Kinase-3β in Hippocampus in Mice

LIU Hui-li,ZHAO Gang.Department of Sport Medicine,China Medical University,Shenyang 110001,Liaoning, China

ObjectiveTo investigate the effects of low intensity treadmill training on spatial learning and memory and expression of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β)in hippocampus in mice.Methods24 female C57BL/6J mice of 3 months were assigned into control group(n=12)and exercise group(n=12).They were assessed with Morris Water Maze task 5 months after exercise.The GSK-3β protein and mRNA expressed in hippocampus were determined 1 week after the task.ResultsThe latency and path length to escape onto the hidden platform decreased in the exercise group(P＜0.05),while the cross times increased(P＜0.05)compared with the control group.The level of GSK-3β mRNA decreased(P＜0.05)and ratio of p-GSK-3β-Ser9 to GSK-3β increased(P＜0.05)as well.ConclusionLow intensity treadmill exercise may improve the spatial learning and memory in mice,which may down-regulate the expression and activity of GSK-3β.

treadmill exercise;spatial learning and memory;glycogen synthase kinase-3β;mice

R455

A

1006-9771(2013)11-1016-04

2013-04-08

2013-04-24)

國家自然科學(xué)基金(No.31100857)。

中國醫(yī)科大學(xué)運(yùn)動醫(yī)學(xué)系，遼寧沈陽市110001。作者簡介：劉慧莉(1977-)，女，黑龍江伊春市人，博士，副教授，主要研究方向：運(yùn)動與學(xué)習(xí)和記憶。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.005