王濤，喬洪文，劉雁勇，楊楠，紀超，陳彪，左萍萍

·專題·

28烷醇對6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠的行為學(xué)作用及其機制研究①

王濤1，喬洪文1，劉雁勇2，楊楠2，紀超2，陳彪1，左萍萍2

目的 觀察28烷醇對帕金森病模型大鼠的行為學(xué)改善作用與中腦水平神經(jīng)生長因子(NGF)、神經(jīng)生長因子前體(proNGF)及其各自受體表達的變化。方法將6-羥基多巴胺(6-OHDA)通過立體定位儀注入大鼠右側(cè)紋狀體，以28烷醇17.5 mg/kg (低劑量組)、35 mg/kg(中劑量組)、70 mg/kg(高劑量組)進行干預(yù)。給藥2周后行阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)測試和平衡桿測試；TUNEL染色檢測紋狀體內(nèi)的細胞凋亡情況；Western印跡法檢測caspase-3、NGF及其受體、proNGF及其受體蛋白表達情況。結(jié)果與模型組相比，中劑量和高劑量組旋轉(zhuǎn)試驗和平衡桿實驗成績改善(P＜0.05)；高劑量組紋狀體內(nèi)凋亡小體減少(P＜0.05)，NGF及其受體TrkA表達增高(P＜0.05)，proNGF及其受體sortilin和p75NTR表達降低(P＜0.05)，caspase-3表達減少(P＜0.05)。結(jié)論28烷醇可改善帕金森病大鼠病理行為。其神經(jīng)保護機制可能是調(diào)節(jié)NGF介導(dǎo)的細胞存活通路和proNGF介導(dǎo)的凋亡通路相關(guān)蛋白表達，進而減少神經(jīng)細胞凋亡。

帕金森??；神經(jīng)生長因子；神經(jīng)生長因子前體；神經(jīng)保護；凋亡；大鼠

[本文著錄格式]王濤，喬洪文，劉雁勇，等.28烷醇對6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠的行為學(xué)作用及其機制研究[J].中國康復(fù)理論與實踐,2013,19(11):1001-1005.

帕金森病是常見的與衰老有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。根據(jù)我國的一項調(diào)查，65歲以上人群中，帕金森病的患病率為1.7%[1]，尚未診斷的帕金森病患者大約還有300萬～400萬。隨著我國人口老齡化的加劇，帕金森病患者數(shù)也將會在未來20年呈急劇上升趨勢。目前尚無治愈疾病的有效方法，多巴胺替代療法只能控制運動系統(tǒng)的癥狀，但不能阻止病理進程。因此，尋求阻止或延緩帕金森病病理進程的神經(jīng)保護治療是帕金森病治療的根本措施[2]。28烷醇是一種從米糠蠟、甘蔗蠟等中提取的天然長鏈高級脂肪醇。它可有效降低血清膽固醇水平，抗脂質(zhì)過氧化，抑制血小板凝聚，抑制血管內(nèi)皮平滑肌細胞的增生等[3]。初步臨床研究顯示，一定劑量的28烷醇對帕金森病患者有一定療效[4]。本實驗觀察28烷醇對帕金森病模型大鼠的行為學(xué)改善作用及其分子學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康Sprague-Dawley大鼠63只，雄性，體重210～220g，鼠齡3個月，由北京維通利華動物公司提供。行為學(xué)測試無異常。按照體重從輕到重順序為動物編號(1～63號)，利用隨機數(shù)字表，63只大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=10)和造模組(n=53)。

1.2 主要試劑和藥品

28烷醇單體由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所朱海波教授惠贈，以含0.5%縮甲基纖維素鈉(CMC)水助溶制成懸浮液。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、阿樸嗎啡(Apomorphine,APO)：美國SIGMA公司；兔多克隆抗神經(jīng)生長因子前體(precursor of nerve growth factor,proNGF)抗體：CHEMICON公司；神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)和sortilin抗體：ABCAM公司；p75NTR抗體：UPSTATE公司；兔多抗caspase-3、phospho-TrkA(p-TrkA)及actin抗體：SANTA CRUZ公司；HRP標記羊抗兔二抗及SP-9002免疫組化試劑盒：北京中杉金橋公司；TUNEL凋亡試劑盒：美國羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 帕金森病大鼠模型的制備 造模組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，顱平位固定于大鼠腦立體定向儀。剪開頭皮并剝離骨膜，確定具體坐標并標記，用牙科鉆小心鉆透顱骨。根據(jù)Paxinos Watson圖譜，確定右側(cè)紋狀體(CPU)坐標，行兩點注射[5]：前囟前0.5 mm，矢狀線旁開2.5 mm，硬膜下5.0 mm；前囟后0.5 mm，矢狀線旁開4.2 mm，硬膜下5.0 mm。兩點各注射6-OHDA 15 μg，3 μl(溶于含0.2%抗壞血酸的生理鹽水)，注射速度1 μl/min，留針10 min，緩慢退針3 min(1 mm/min)。假手術(shù)組用相同方法兩點注射同體積含0.2%抗壞血酸的生理鹽水。術(shù)后模型成功標準參考文獻[6]。

1.3.2 帕金森病大鼠模型篩選 術(shù)后第4周開始對53只造模組大鼠進行旋轉(zhuǎn)實驗篩選：阿樸嗎啡0.5 mg/kg頸部皮下注射，觀察行為變化30 min；若大鼠恒定轉(zhuǎn)向健側(cè)，且旋轉(zhuǎn)圈數(shù)＞150 r，每分鐘最大旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥7，表示毀損穩(wěn)定，視為造模成功。共40只造模組大鼠成功。

1.3.3 模型大鼠分組及給藥 造模成功的大鼠按旋轉(zhuǎn)圈數(shù)從少到多順序為動物進行編號(1～40號)，利用隨機數(shù)字表隨機分為模型組(n=10)、低劑量組(n=10)、中劑量組(n=10)和高劑量組(n=10)。分組后第1天，低、中、高劑量組大鼠分別給予28烷醇17.5 mg/kg、35 mg/kg、70 mg/kg，每天灌胃給藥1次，模型組及假手術(shù)組給等量0.5%CMC水，連續(xù)給藥2周。

1.3.4 行為學(xué)檢測 給藥2周后，行阿樸嗎啡誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)試驗和平衡桿試驗。

1.3.4.1 阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗 阿樸嗎啡0.5 mg/kg行大鼠頸部皮下注射，觀察并記錄其在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)向健側(cè)的圈數(shù)。

1.3.4.2 平衡桿試驗[7]平衡木桿105×4×3 cm，離地80 cm，兩端由木架支撐。木桿的一端為起始區(qū)，長20 cm，另一端為終點區(qū)，終點區(qū)后接一個大鼠籠，木桿下有1×1 m、厚12 cm墊子防止大鼠摔傷。

實驗時，將大鼠放在起始區(qū)，面對鼠籠方向，開始計時。記錄大鼠走過起始區(qū)的時間(潛伏期)和大鼠走過整個平衡桿的時間。潛伏期最大允許時間為1 min，走過橫桿最大允許時間為2 min。大鼠先訓(xùn)練3次，然后開始正式實驗。

1.3.5 TUNEL染色 行為學(xué)檢測后，每組3只大鼠戊巴比妥鈉50 mg/kg深度麻醉，剪開胸腔，暴露心臟，從左心尖處插入灌流針，剪開右心耳。先用PBS灌流，待血液沖洗干凈后改用4%多聚甲醛繼續(xù)灌流約15 min。斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃過夜。15%、20%和30%蔗糖溶液梯度脫水，4℃存放。冰凍切片機切取冠狀腦片，片厚30 μm，收集于標本保護液中，-20℃保存。TUNEL染色步驟參照羅氏公司提供的產(chǎn)品說明書，DAB顯色、干燥封片。每只動物取對應(yīng)部位2張腦片統(tǒng)計凋亡小體，分析軟件為Image-Pro Plus。

1.3.6 蛋白表達 行為學(xué)檢測后，每組取6只大鼠迅速斷頭取腦，在冰面上迅速分離出兩側(cè)紋狀體，-80℃冰箱保存。將各組右側(cè)(患側(cè))紋狀體放在平皿中，加入適量新鮮配制的RIPA裂解液，剪刀剪碎組織塊(冰上操作)；4℃ 3000 g離心5 min；棄上清，預(yù)冷PBS重復(fù)離心洗滌組織沉淀，至液體無紅色；將組織沉淀轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器，按30 mg組織加入RIPA裂解液10 ml/mg組織，冰上反復(fù)勻漿0.5～l h；4℃ 14,000 g離心15 min，取上清。用Bradford法定量蛋白。Western印跡電泳方法參見文獻[8]。所有Western印跡實驗至少重復(fù)3次，電泳條帶結(jié)果定量分析采用Alpha-Ease?FC軟件，相對密度采用靶蛋白/內(nèi)參蛋白(actin)比值表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)

在阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗中，模型組動物在30 min內(nèi)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)高于假手術(shù)組(P＜0.001)；低劑量組30 min向健側(cè)旋轉(zhuǎn)次數(shù)與模型組無顯著性差異，而中劑量組及高劑量組30 min內(nèi)旋轉(zhuǎn)次數(shù)均減少(P＜0.05)。在平衡桿試驗中，與假手術(shù)組相比，模型組潛伏期和過桿總時間均增加(P＜0.05)；給藥2周后，中劑量組和高劑量組的潛伏期和過桿總時間較模型組減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 TUNEL染色

與假手術(shù)組相比，模型組患側(cè)紋狀體區(qū)多數(shù)區(qū)域出現(xiàn)明顯細胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)在局部區(qū)域凝集，致密濃染，凋亡陽性細胞顯著增多(P＜0.001)；與模型組相比，中劑量和高劑量組患側(cè)紋狀體內(nèi)凋亡陽性細胞減少(P＜0.05)。見圖1、表2。

表1 各組行為學(xué)指標比較

表2 各組TUNEL陽性細胞數(shù)比較(/mm2)

圖1 各組紋狀體TUNEL染色

2.3 蛋白表達

模型組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，高劑量組低于模型組(P＜0.05)。

模型組介導(dǎo)細胞存活通路的NGF及其受體TrkA的磷酸化(活化)水平明顯低于假手術(shù)組(P＜0.01)，介導(dǎo)細胞凋亡通路的proNGF及其受體sortilin及p75NTR高于假手術(shù)組(P＜0.05)；中劑量組和高劑量組NGF及TrkA表達高于模型組(P＜0.05)，而proNGF、sortilin和p75NTR表達低于模型組(P＜0.05)。見表3。

表3 各組紋狀體內(nèi)蛋白表達相對光密度(/actin)

3 討論

28烷醇是從植物蠟中提取的天然長鏈高級脂肪醇(CH3[CH2]27OH，分子量410.77)，是新型調(diào)脂非處方藥普利醇的主要成分。普利醇作為一種與他汀類不同的降脂藥物，可有效降低血清膽固醇水平，抑制血小板凝聚和血管內(nèi)皮平滑肌細胞增生等。28烷醇在體內(nèi)吸收分布較快[9]，具有增強體力、精力和耐力，安全性和耐受性好等特點，為帕金森病的臨床治療和干預(yù)提供了新的潛在單體藥物。

本研究使用腦立體定位技術(shù)，將6-OHDA單側(cè)紋狀體兩點注射，構(gòu)建帕金森病大鼠模型。并采用2項帕金森病行為學(xué)指標進行藥效學(xué)評價。①阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗，其原理是多巴胺(DA)神經(jīng)末梢及黑質(zhì)區(qū)的多巴胺神經(jīng)元被6-OHDA選擇性損毀，敏感性增高，出現(xiàn)超敏現(xiàn)象，注射多巴胺受體激動劑阿樸嗎啡，可使模型動物向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為；②平衡桿實驗，包括潛伏期和過桿總時間兩項指標，分別評估大鼠的運動始動性和運動平衡能力[7]。行為學(xué)檢測結(jié)果顯示，帕金森病模型大鼠因患側(cè)黑質(zhì)紋狀體通路受損而致向健側(cè)產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)行為次數(shù)明顯增多，運動始動性和運動平衡能力明顯下降，與文獻報道一致[7,10]。表明我們建立的帕金森病大鼠模型可靠。連續(xù)給予28烷醇2周后，中劑量組和高劑量組行為學(xué)指標均有明顯改善，說明28烷醇可以改善模型大鼠的運動功能，具有較好的抗帕金森病藥效。

NGF是最早被發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)，對維持神經(jīng)元的存活、生長、分化以及神經(jīng)損傷后的修復(fù)與神經(jīng)元再生有十分重要的作用[11-12]。NGF與其高親和受體TrkA結(jié)合于細胞表面后，TrkA磷酸化，形成二聚體?；罨腡rkA可介導(dǎo)磷脂酰肌醇-3激酶(PI3-K)/Akt信號通路。激活的Akt通過磷酸化與胞漿和核中其他信號因子相互作用來促進細胞存活并抑制凋亡[13]。

proNGF為NGF前體形式，它可促進NGF的折疊和調(diào)節(jié)分泌，并根據(jù)需要在胞內(nèi)被蛋白酶水解裂解成NGF；另一面，proNGF與受體p75NTR和sortilin結(jié)合，并以高親和性形成雜合三聚體，啟動下游凋亡通路，導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡[14]。

本研究采用Western印跡法檢測帕金森病模型大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)的NGF-TrkA蛋白表達，結(jié)果顯示，模型組NGF和p-TrkA蛋白表達均降低，提示6-OHDA神經(jīng)毒性對大鼠腦內(nèi)NGF介導(dǎo)的細胞存活通路有明顯抑制作用；TUNEL染色顯示模型大鼠患側(cè)紋狀體內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡陽性細胞，推測由于NGF細胞存活信號通路受到抑制，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)出現(xiàn)大量神經(jīng)細胞凋亡；模型組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達水平升高也證實了這一點。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，中高劑量28烷醇治療可以減少紋狀體內(nèi)細胞凋亡，NGF、p-TrkA蛋白表達有不同程度上升，對抗6-OHDA的神經(jīng)毒性作用。

近年來，較多文獻認為神經(jīng)細胞生存或死亡取決于NGF和proNGF的平衡[15-17]。Western印跡結(jié)果顯示，模型組大鼠紋狀體proNGF及下游復(fù)合受體sortilin/p75NTR蛋白表達均增高，提示6-OHDA神經(jīng)毒性可明顯提高proNGF及其復(fù)合受體sortilin/p75NTR蛋白表達，激活下游細胞凋亡信號通路，這與我們在TUNEL染色和caspase-3蛋白電泳實驗中觀察到的結(jié)果一致。高劑量28烷醇可逆轉(zhuǎn)介導(dǎo)凋亡信號通路的proNGF及其受體sortilin/p75NTR及下游凋亡蛋白caspase-3的過表達。

綜合以上實驗結(jié)果，神經(jīng)毒素6-OHDA下調(diào)NGF及TrkA蛋白表達，同時上調(diào)proNGF-sortilin/p75NTR蛋白表達，促進細胞凋亡；而不同劑量28烷醇通過調(diào)節(jié)proNGF介導(dǎo)的細胞凋亡通路和NGF介導(dǎo)的細胞存活通路，可以部分逆轉(zhuǎn)上述促凋亡效應(yīng)。

目前國內(nèi)對神經(jīng)營養(yǎng)類因子的多數(shù)研究只局限于對單一信號通路的觀察。例如，對NGF的神經(jīng)保護研究大多只圍繞著NGF及其介導(dǎo)的下游信號通路機制進行闡述，忽視了重要的前體形式proNGF及其受體p75NTR/sortilin在腦內(nèi)的變化；神經(jīng)細胞的存活或凋亡，取決于NGF與proNGF[18]及其受體TrkA和p75NTR/sortilin的對比，而不是僅取決于NGF介導(dǎo)的細胞存活通路[15-17]。

本研究闡述28烷醇對6-OHDA致帕金森病大鼠模型的行為學(xué)改善作用，探討28烷醇的神經(jīng)保護機制與其同時調(diào)節(jié)NGF介導(dǎo)的細胞存活通路和proNGF介導(dǎo)的細胞凋亡通路相關(guān)。為28烷醇應(yīng)用于抗帕金森病臨床藥物干預(yù)提供了理論依據(jù)。

[1]Zhang ZX,Roman GC,Hong Z,et al.Parkinson's disease in China:prevalence in Beijing,Xi'an,and Shanghai[J].Lancet, 2005,365(9459):595-597.

[2]Santos CM.New agents promote neuroprotection in Parkinson's disease models[J].CNS Neurol Disord Drug Targets, 2012,11(4):410-418.

[3]Taylor JC,Rapport L,Lockwood GB.Octacosanol in human health[J].Nutrition,2003,19(2):192-195.

[4]Snider SR.Octacosanol in Parkinsonism[J].Ann Neurol,1984, 16(6):723.

[5]王濤,劉亞靜,劉雁勇,等.28醇對6-羥基多巴胺致帕金森病大鼠模型行為學(xué)的改善作用[J].中國康復(fù)理論與實踐,2011,17 (11):1025-1027.

[6]王濤,紀超,黎青,等.帕金森病模型大鼠紋狀體內(nèi)氧化應(yīng)激與細胞凋亡蛋白的表達[J].中國康復(fù)理論與實踐,2009,15(5): 431-433.

[7]Allbutt HN,Henderson JM.Use of the narrow beam test in the rat,6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease[J].J Neurosci Methods,2007,159(2):195-202.

[8]Ji C,Song C,Aisa HA,et al.Gossypium herbaceam L.extracts ameliorate disequilibrium of IL-1RA/IL-1β ratio to attenuate inflammatory process induced by amyloid β in rats[J].Curr Alzheimer Res,2012,9(8):953-961.

[9]Sierra R,Gonzalez VL,Magraner J.Validation of a gas chromatographic method for determination of fatty alcohols in 10 mg film-coated tablets of policosanol[J].J AOAC Int,2002,85 (3):563-566.

[10]Sleeman IJ,Boshoff EL,Duty S.Fibroblast growth factor-20 protects against dopamine neuron loss in vitro and provides functional protection in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease[J].Neuropharmacology,2012,63 (7):1268-1277.

[11]Lad SP,Neet KE,Mufson EJ.Nerve growth factor:structure, function and therapeutic implications for Alzheimer's disease[J].Curr Drug Targets CNS Neurol Disord,2003,2(5): 315-334.

[12]周宏珍,呂田明,申鵬,等.神經(jīng)生長因子與丹參對腦缺血再灌注海馬神經(jīng)元的保護作用[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,31 (6):965-969.

[13]Ahn JY,Rong R,Liu X,et al.PIKE/nuclear PI3-kinase signaling mediates the antiapoptotic actions of NGF in the nucleus[J].EMBO J,2004,23(20):3995-4006.

[14]Lee R,Kermani P,Teng KK,et al.Regulation of cell survival by secreted proneurotrophins[J].Science,2001,294(5548): 1945-1948.

[15]Chao MV,Bothwell M.Neurotrophins:to cleave or not to cleave[J].Neuron,2002,33(1):9-12.

[16]Capsoni S,Brandi R,Arisi I,et al.A dual mechanism linking NGF/proNGF imbalance and early inflammation to Alzheimer's disease neurodegeneration in the AD11 anti-NGF mouse model[J].CNS Neurol Disord Drug Targets,2011,10(5): 635-647.

[17]Cekic M,Johnson SJ,Bhatt VH,et al.Progesterone treatment alters neurotrophin/proneurotrophin balance and receptor expression in rats with traumatic brain injury[J].Restor Neurol Neurosci,2012,30(2):115-126.

[18]Tiveron C,Fasulo L,Capsoni S,et al.ProNGFNGF imbalance triggers learning and memory deficits,neurodegeneration and spontaneousepileptic-like dischargesin transgenic mice[J].Cell Death Differ,2013,20(8):1017-1030.

Effects of Octacosanol on Behavioral Impairments and Its Mechanism through Nerve Growth Factor Mediated Pathway in Parkinsonism Rats Induced with 6-hydroxydopamine

WANG Tao,QIAO Hong-wen,LIU Yan-yong,et al.Department of Neurobiology,Beijing Institute of Geriatrics,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo investigate the effects of octacosanol on the behavioral changes and its potential mechanism in 6-hydroxydopamine-induced Parkinsonism rats.Methods6-hydroxydopamine-induced Parkinsonism rats accepted octacosanol orally in the dosage of 17.5 mg/kg(low dose),35 mg/kg(medium dose)and 70 mg/kg(high dose)for 2 weeks,and then assessed with rotating test and narrow beam test.The apoptosis cells were counted with TUNEL assay,and the expression of nerve growth factor(NGF),precursor of nerve growth factor(proNGF),as well as their receptors were detected with Western blotting.ResultsThe achievement of behavioral tests significantly improved after administration of octacosanol(P＜0.05),with the decrease of the apoptotic cells,more expression of NGF and its receptors TrkA,and less expression of caspase-3,proNGF and its receptors p75NTR and sortilin,especially at the dosage of 70 mg/kg(P＜0.05).ConclusionOctacosanol may protect the neurol impairment from 6-hydroxydopamine through NGF mediated pathway to decrease the apoptosis.

Parkinson's disease;nerve growth factor;precursor of nerve growth factor;neuroprotection;apoptosis;rats

R742.5

A

1006-9771(2013)11-1001-05

2013-06-16

2013-08-12)

1.國家973基金項目(No.2010CB934002;No.2011CB504101;No.2011CBA00408)；2.國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81050025)；3.神經(jīng)變性病教育部重點實驗室開放課題(No.2012SJBX01)；4.北京市腦重大疾病重點實驗室開放課題(No.2013NZDJ05)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京市100053；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理室，北京市100730。作者簡介：王濤(1980-)，男，漢族，遼寧大連市人，博士，助理研究員，主要研究方向：抗帕金森病新藥藥效學(xué)及機制研究。通訊作者：左萍萍(1950-)，女，湖南長沙市人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)。

10.3969/j.issn.1006-9771.2013.11.001