江云，王少華,2，王錚敏,2

(1.三明學院資源與化工學院，福建三明365004；2.三明學院應用生物技術(shù)研究所，福建三明365004)

藍花參內(nèi)生真菌的初步分離鑒定

江云1，王少華1,2，王錚敏1,2

(1.三明學院資源與化工學院，福建三明365004；2.三明學院應用生物技術(shù)研究所，福建三明365004)

為探索藍花參（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）內(nèi)生真菌的種類，對藍花參植物的莖、葉進行內(nèi)生真菌的分離純化，獲得10株內(nèi)生真菌，表明藍花參內(nèi)生真菌的多樣性較為豐富；其中產(chǎn)孢特征明顯的4株經(jīng)形態(tài)學鑒定分別屬于大果粗孢曲霉屬(Lilliputia Boud.et Pat.)、鏈格孢屬(Alternaria Nees)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces Linder)和雙足囊菌屬(Dipodascus Lagerh.)。

藍花參；內(nèi)生真菌；分離；多樣性

藍花參（Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC.）是桔?？扑{花參屬植物，別名寒草、金線吊葫蘆等，分布于福建各地且民間應用廣泛[1-2]。已有的研究表明，藍花參有抗菌、殺菌、抗炎、抗癌、免疫力抑制等作用，可補虛健脾、化痰止咳、保護乙醇造成的胃粘膜受損等功效[3-4]；全草含植物甾醇、三萜成分、內(nèi)酯、香豆素、多糖、酚性成分等[5-6]，其化學成分復雜且含量極低、不易提取[7-9]。但對其內(nèi)生真菌的多樣性、內(nèi)生真菌的發(fā)酵及其產(chǎn)物的鑒定、發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有類似生物活性物質(zhì)等研究目前尚未見文獻報道。本文采用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定法嘗試對藍花參內(nèi)生真菌進行初步分離鑒定，以期了解其多樣性，為今后尋找利用真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然藥物的研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

健康粗壯的藍花參全草采自福建省三明市三明學院校園。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），查氏培養(yǎng)基[10]。

1.3 內(nèi)生真菌的分離、純化

根據(jù)楊春燕等分離方法[11-13]稍做修改。

用自來水流水沖洗、去除植株污泥后，用20％洗衣粉浸泡10 min；再用自來水流水沖洗30 min后置于干凈的紗布上；用吸水紙吸干植物體的表面水分。

（1）樣品的表面消毒：取植物的莖和葉分別用無菌水洗凈、切割后進行表面消毒，處理方法見表1。

表1 植物樣品的表面消毒

（2）內(nèi)生真菌的分離：將表面消毒后的植物樣品用無菌手術(shù)剪剪切（莖段去掉兩端、再剪切成0.2 cm小段；葉片除去邊緣四周，再剪切成0.5 cm×0.5 cm），放置在PDA培養(yǎng)基平皿上，置22℃溫箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)3～7 d后即可見樣品邊緣有菌絲長出，挑取菌絲到PDA平板上分離、純化；純化后的菌株轉(zhuǎn)到PDA斜面培養(yǎng)基上4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為檢查表面消毒和無菌操作是否徹底，設對照1：未切割兩端和任何剪切的消毒莖段；對照2：未做任何剪切的消毒葉片；對照3：在超凈臺上放置5個敞開蓋子的PDA培養(yǎng)基平皿，直到實驗完成；對照4：將升汞消毒后的最后一次漂洗無菌水涂布于PDA培養(yǎng)基上。將上述對照同樣置22℃溫箱中培養(yǎng)。結(jié)果均無任何菌絲長出，證明植物組織塊表面消毒徹底，無菌操作合格，確保篩選到的菌種為內(nèi)生真菌。

1.4 內(nèi)生真菌的鑒定

采用點植培養(yǎng)法[10]，挑取微量菌絲點植在查氏培養(yǎng)基平板的中心位置，然后于28℃溫箱培養(yǎng)10 d，記錄每天菌落的大小、顏色、表面紋飾、質(zhì)地、高度、菌落邊緣形狀等。

內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定[14-16]：用查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)分離純化過的菌種數(shù)日后，挑取菌絲或孢子用溴酚藍染色制成玻片，在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、菌絲顏色及有無橫隔等特征。

2 結(jié)果

2.1 藍花參內(nèi)生真菌的分離

對樣品表面長出的菌絲進行分離純化，結(jié)果見表2。

2.2 藍花參內(nèi)生真菌的鑒定

對純化菌株菌絲及分生孢子的形態(tài)學特征進行觀察，鑒定出4種具有明顯的孢子形態(tài)的內(nèi)生真菌分別屬于大果粗孢曲霉屬（Lilliputia Boud. et Pat.）、鏈格孢屬（Alternaria Nees）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces Linder）和雙足囊菌屬（Dipodascus Lagerh.），結(jié)果見表3和圖1～4。

表2 內(nèi)生真菌的分離結(jié)果

表3 內(nèi)生真菌的鑒定結(jié)果

續(xù)表3

圖1 Lilliputia Boud.et Pat.（LJ1）（×40）

圖2 Alternaria Nees（LJ3）（×40）

圖3 Schizosaccharomyces Linder（LJ7）（×40）

圖4 Dipodasous Lagerh.（LY1）（×40）

3 結(jié)論與討論

本實驗采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，以75％酒精和0.1％升汞作表面消毒劑，從藍花參植物分離到10株內(nèi)生真菌，顯示藍花參內(nèi)生真菌的多樣性較為豐富。對其中產(chǎn)孢子且孢子特征明顯的4種進行鑒定、分別為半知菌亞門的4個屬：大足粗孢曲霉屬(Lilliputia Boud,et,Pat)、鏈格孢屬(Alternaria Nees)、裂殖酵母屬(Schinosaccharomyces Linder)、雙足囊菌屬(Dipodasous Lagerh)。

在純化的10個菌株中，只對產(chǎn)孢子且孢子特征明顯的4種進行鑒定，還有不產(chǎn)孢子或孢子特征不明顯的6種還需通過促孢子培養(yǎng)等實驗進一步完成，說明用傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定內(nèi)生真菌存在一定局限。后續(xù)研究中可以通過分子生物學手段進行ITS序列的測定，更加快速、準確地了解藍花參內(nèi)生真菌的種類。實驗植株的選取可能對內(nèi)生菌株的產(chǎn)生多寡有一定關系。選用健康粗壯的植株能夠獲取更多的內(nèi)生菌株，但是否有關聯(lián)有待進一步研究。

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Separation of the Endophytic Fungus on Wahlenbergia marginata(Thunb.)A.DC. of Fujian Sanming

JIANG Yun1,WANG Shao-hua1,2,WANG Zheng-min1,2
(1.School of Resources and Chemical Engineering,Sanming University,Sanming 365004,China; 2.Institute of Applied Biotechnology,Sanming College,Sanming 365004,China)

10 strains of endophytic funguses were separated from the stems and the leaves of Wahlenbergia marginata (Thunb.)A.DC.in order to explore its species.The results showed that the endophytic funguses of Wahlenbergia marginata own a great variety of diversity,which 4 strains were classified into Lilliputia Boud.et Pat.,Alternaria Nees,Schizosaccharomyces Linder and Dipodascus Lagerh.based on morphological characters.

Wahlenbergia marginata；endophytic fungi；separate,diversity

Q93.331

A

1673-4343（2013）06-0067-04

2013-09-28

福建省教育廳科技項目（JA10264）;三明市科技局科技項目（2009-s-1）;福建省高校服務海西重點項目（HX200801）

江云，男，福建福州人，大學生。通訊作者：王錚敏，女，福建福州人，副教授。研究方向：植物學。