沈紅石，陳海飛，任傳路，李征洋，唐杰慶，王 靜，吳天勤

(中國(guó)人民解放軍第100醫(yī)院，江蘇蘇州215007)

再生障礙性貧血(AA)是一種以全血細(xì)胞減少與骨髓造血功能衰竭為特征的骨髓造血系統(tǒng)疾病。其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，免疫介導(dǎo)的造血抑制是AA最常見(jiàn)、目前研究最多的發(fā)病機(jī)制。已有研究表明，AA發(fā)生造血功能衰竭與細(xì)胞免疫功能異常、大量寡克隆淋巴細(xì)胞及/或自然殺傷細(xì)胞局部浸潤(rùn)、多種細(xì)胞因子分泌失調(diào)及造血微環(huán)境受損等因素有關(guān)［1～3］，因此進(jìn)一步了解AA的免疫發(fā)病機(jī)制對(duì)AA的臨床診斷及治療等方面有著重要的意義。T-bet、GATA-3分別為T(mén)h1、Th2細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxP3為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子。本研究通過(guò)檢測(cè)AA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中轉(zhuǎn)錄因子 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的表達(dá)、血漿中Th1類(lèi)細(xì)胞因子IFN-γ和Th2類(lèi)細(xì)胞因子IL-4水平及AA患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平，從轉(zhuǎn)錄因子水平為AA的臨床診斷和治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2008年1月～2011年5月我院血液科門(mén)診就診及病房中的患者27例(AA組)，其臨床骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化及細(xì)胞遺傳學(xué)檢查符合AA診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。其中男17例、女10例，年齡19～58(33±9.8)歲，病程5～235(20±17.6)個(gè)月。對(duì)照組選擇健康體檢者25例，其中男16例、女9例，年齡20～59(32±8.3)歲。

1.2 標(biāo)本采集 AA組與對(duì)照組均抽取外周靜脈血8 mL，其中EDTA抗凝6 mL，肝素鈉抗凝2 mL。后者經(jīng)培養(yǎng)16～20 h后用于T細(xì)胞亞群的檢測(cè)。EDTA抗凝外周血6 mL分離PBMC，提取總mRNA，-80℃低溫凍存?zhèn)溆谩Ｓ糜?T-bet、GATA-3和FoxP3的測(cè)定。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA的檢測(cè) 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)這3種轉(zhuǎn)錄因子水平。TRIzol、FQPCR試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Gibco-BRL，ABI7300型Real Time PCR檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)公司。通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)中心GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索T-bet、GATA-3、FoxP3、GAPDH mRNA 序列，利用美國(guó)Whitehead生物醫(yī)學(xué)研究所Primer3程序設(shè)計(jì)探針，參考文獻(xiàn)方法設(shè)計(jì)上下游引物，由上海申友生物技術(shù)有限公司合成。探針及引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)定量FQ-PCR總反應(yīng)體系25 μL，其中含2×Quanti Tect SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，樣品 cDNA 1.5 μL。反應(yīng)條件:50 ℃2min，95 ℃15min;94 ℃15 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，50次循環(huán)。采用RG-3000實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)定量RT-PCR儀。利用溶解曲線進(jìn)行產(chǎn)物的特異性分析，采用Relative Quantification Software 1.0分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果判斷以同時(shí)擴(kuò)增的內(nèi)參照GAPDH的表達(dá)強(qiáng)度為基準(zhǔn)，表達(dá)強(qiáng)度以轉(zhuǎn)錄因子/GAPDH的基因拷貝數(shù)的比值來(lái)表示。

表1 T-bet、GATA-3、FoxP3及GAPDH探針及引物序列

1.3.2 T細(xì)胞亞群的檢測(cè) 抗體有FITC標(biāo)記的鼠抗人 CD4、CD25、CD3抗體，PE 標(biāo)記的 CD25，同型對(duì)照抗體為PE標(biāo)記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白、FITC標(biāo)記的鼠抗人IgG1免疫球蛋白均為美國(guó) BD公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人細(xì)胞。采靜脈血2 mL，肝素抗凝，兩倍體積的PBS稀釋?zhuān)捎昧馨图?xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL，各取PBMNC懸液10 μL于標(biāo)本試管中，分別加入FITC標(biāo)記的CD4和PE標(biāo)記的CD25各20 μL，陰性對(duì)照管加入 FITC標(biāo)記的CD4和PE標(biāo)記的鼠 IgG1各20 μL，室溫避光孵育20min，加冷PBS洗滌1次，重新懸浮細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.3 血漿IFN-γ和IL-4的檢測(cè) 血漿IFN-γ和IL-4的測(cè)定，采用ELISA雙抗夾心法，操作按試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D systems公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較用雙t檢驗(yàn)，組間計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA表達(dá)量比較 與對(duì)照組相比，AA組的T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P＜0.01)，GATA-3、FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P＜0.05，P＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表2 兩組轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3、FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

組別 n T-bet GATA-3 FoxP3 AA組 27 4.78±1.24△ 1.08±0.12* 0.26±0.01△對(duì)照組25 1.12±0.17 1.27±0.41 1.31±0.11

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05，△P ＜0.01

2.3 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較 AA組血漿中IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4高于對(duì)照組(P均＜0.01)。見(jiàn)表4。

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

表4 兩組血漿IFN-γ和IL-4水平比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.01

組別 n IFN-γ(pg/mL)IL-4(pg/mL) IFN-γ/IL-4對(duì)照組25 8.57±0.85 4.86±0.68 1.65±0.42 AA組 27 15.32±2.97* 5.42±0.49 2.54±0.46*

3 討論

AA的發(fā)病機(jī)制除與造血干細(xì)胞本身缺陷、造血微環(huán)境損傷有關(guān)外，免疫異常是一個(gè)絕對(duì)不可忽視的因素。現(xiàn)有學(xué)者認(rèn)為，大多數(shù)患者發(fā)病與自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的造血干細(xì)胞受損有關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果表明，AA患者外周血中Th1細(xì)胞及Th1/Th2均明顯高于正常對(duì)照人群［5］，即 AA患者 Th1、Th2之間的分化平衡被打破，并發(fā)展為T(mén)h1型優(yōu)勢(shì)的免疫應(yīng)答，存在Th1細(xì)胞的過(guò)度分化和Th1型細(xì)胞因子的過(guò)度分泌。研究發(fā)現(xiàn)，T-bet是Th1特異的轉(zhuǎn)錄因子［6］，不僅控制 Th1細(xì)胞特征性細(xì)胞因子 IFN-γ的表達(dá)，且抑制Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IL-4的合成［7］。GATA-3則是Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，能抑制IFN-γ的表達(dá)，促進(jìn)Th2細(xì)胞特征性細(xì)胞因子IL-4等的產(chǎn)生。FoxP3(叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3)是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，目前被公認(rèn)為是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最具有特異性的分子標(biāo)志物調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能獨(dú)立表達(dá)Foxp3 mRNA。Foxp3對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一正向調(diào)節(jié)蛋白，可以調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的發(fā)育和功能效應(yīng)，參與了免疫耐受的分子機(jī)制［8］。因此，細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA-3與FoxP3共同調(diào)節(jié)Th細(xì)胞的極性分化。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AA組的T-bet顯著升高，表明AA組患者PBMC中T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組表達(dá)水平。GATA-3和FoxP3降低，表明AA組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞GATA-3和FoxP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組表達(dá)水平。

本研究結(jié)果表明，AA存在T淋巴細(xì)胞亞群的功能紊亂及B淋巴細(xì)胞增殖活化;表現(xiàn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減低，其特異性的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3 mRNA表達(dá)下調(diào)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的減少并由此引起免疫抑制效應(yīng)不足可能是AA發(fā)生的重要原因之一，但AA發(fā)生、發(fā)展的詳細(xì)分子機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

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