薛 婷，吳利先

(云南大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，云南大理671000)

腸球菌是人類和動物腸道正常菌群的一部分，但近年研究已證實其為院內(nèi)感染的重要致病菌［1］。20世紀80年代以來，腸球菌嚴重感染的發(fā)生率和病死率明顯升高，已成為傷口和尿路感染最常見的致病菌，導(dǎo)致菌血癥的第三大致病菌，其中糞腸球菌是與臨床感染相關(guān)的最常見腸球菌，還可引起腹腔感染、肺囊性纖維化、心內(nèi)膜炎和腦膜炎等［2］，并且由于其固有耐藥和獲得性耐藥，使腸球菌感染的治療非常棘手［3］。腸球菌普遍具有形成生物被膜的能力，它可以阻礙或延遲細菌與抗生素接觸，則降低腸球菌對藥物的敏感性，致使感染難以治愈［4］。細菌生物被膜在細菌致病機制及耐藥性形成中均具有重要意義。因此，學(xué)者們開始關(guān)注腸球菌引起的感染，探討腸球菌生物被膜形成的分子機制。細菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］，糞腸球菌生物被膜形成也是如此。我們用PCR技術(shù)對分離的糞球菌生物被膜菌組和浮游菌組細菌中的ebpA、gelE和fsrB三種與生物被膜形成相關(guān)的基因進行檢測，探討糞腸球菌生物被膜形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 無菌操作收集云南省大理學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科2011年10月～2012年5月留置導(dǎo)尿管患者導(dǎo)尿管標本，按衛(wèi)生部頒布《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行培養(yǎng)和生化反應(yīng)。

1.2 主要試劑及儀器 BHI培養(yǎng)基由北京陸橋技術(shù)有限公司提供;PCR試劑，溶菌酶，細菌基因組DNA提取試劑盒以及Ladder Marker均由北京天根生化科技有限公司提供。全自動細菌鑒定及藥敏分析儀VITEK2為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品，PCR擴增儀為PE公司產(chǎn)品，全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)為Syngene公司產(chǎn)品。

1.3 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定 將收集至醫(yī)院的導(dǎo)尿管標本，通過剛果紅培養(yǎng)基、生物被膜半定量檢測以及細菌生理生化反應(yīng)，可疑菌株用全自動細菌鑒定儀鑒定，篩選生物被膜陽性糞腸球菌及其相應(yīng)的浮游菌。

1.4 基因擴增 將鑒定過的細菌培養(yǎng)過夜，用DNA提取試劑盒提取DNA作為模板，根據(jù)Gene Bank中的序列設(shè)計引物。gelE-F:5'-AGT GAA CGC TAC AGA TGG AAC-3'，gelE-R:5'-CGT TCC GTG TAA AGC AAT TCC-3'，長度 145 bp;ebpA-F:5'-AAA AAT GAT TCG GCT CCA GAA-3'，ebpA-R:5'-TGC CAG ATT CGC TCT CAA AG-3'，長度 111 bp;fsrB-F:5'-TGG ATC AGG AAG ATC AAT CAG G-3'，fsrB-R:5'-GTA CGA CGT ATA CAA TAA AGG TTT CG-3'，長度147 bp。取1 μL DNA 為 PCR 模板，濃度為25 μmol/L的上述引物各1 μL為進行 PCR。反應(yīng)條件為:95℃3 min后，按下列參數(shù)循環(huán)35次，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，最后72℃延伸5 min。凝膠成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件進行 χ2統(tǒng)計分析。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)與鑒定 通過剛果紅培養(yǎng)基、生物被膜半定量檢測以及細菌生理生化鑒定得到糞腸球菌生物被膜菌21株及其相應(yīng)的浮游菌21株。

2.2 gelE、ebpA和fsrB基因的PCR擴增結(jié)果 對上述21株生物被膜糞腸球菌及其相應(yīng)的浮游菌行g(shù)elE、ebpA和fsrB基因的PCR擴增后，陽性菌株出現(xiàn)了相應(yīng)的條帶，見圖1～3。

2.3 gelE、ebpA和fsrB基因的檢測結(jié)果分析 21株生物被膜糞腸球菌gelE、ebpA和fsrB基因的陽性率分別是 9.52%(2/21)、95.24%(20/21)和9.52%(2/21);其相應(yīng)的21株浮游菌組糞腸球菌檢測出的陽性率分別是85.71%(18/21)、9.52%(2/21)和90.48%(19/21)，兩者比較(χ2值分別為 24.436、9.348、27.524，P 均 ＜0.05)。

3 討論

圖3 fsrB基因PCR檢測電泳圖

腸球菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染常見的條件病原菌，當(dāng)人體免疫力低下或腸球菌定植部位改變時，可引起泌尿道感染、腹腔感染、傷口感染，甚至菌血癥及敗血癥、心內(nèi)膜炎等。因此，對腸球菌致病性的研究引起了人們的高度重視。

細菌生物被膜的形成是由某些獨特基因所控制的［5］。gelE基因編碼的明膠酶，gelE的表達由 fsr編碼的密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控，與糞腸球菌生物被膜的形成有關(guān)。fsr調(diào)節(jié)基因座由fsrA、fsrB和fsrC三個基因組成，編碼糞腸球菌fsr密度感應(yīng)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以通過影響明膠酶的生成影響生物膜的形成，fsr缺失突變株減少了聚苯乙烯平板上腸球菌生物膜形成［6，7］。菌毛形成是生物膜形成的必要條件，由多種類型的前體蛋白交聯(lián)構(gòu)成。ebp基因座編碼菌毛，ebp操縱子包含ebpA、ebpB、ebpC和相關(guān)的srtC(編碼分選酶C)基因［8］。糞腸球菌菌毛缺失突變株減少了糞腸球菌菌毛操縱子ebpA、B、C的表達，減少了菌毛的產(chǎn)生，導(dǎo)致原發(fā)粘附的缺失，不能形成生物膜［9］。本實驗采用PCR技術(shù)檢測所篩選的21株糞腸球菌生物被膜菌及其浮游狀態(tài)菌的gelE、ebpA和fsrB基因，發(fā)現(xiàn)ebpA代表的菌毛操縱子在生物被膜陽性組中表達率高于浮游菌組，而gelE與fsrB基因的結(jié)果相反，生物被膜組中表達率均要低于浮游菌組，這與文獻相一致［10］。

因此，可推測ebpA基因能促進糞腸球菌生物被膜形成;gelE和fsrB基因可抑制生物被膜形成。這將為進一步研究腸球菌生物被膜形成的分子機制，深入確定可行的藥物靶點和小分子物質(zhì)，以達到抑制生物被膜形成和抑制感染期病原體毒性，來解決實際臨床難題提供依據(jù)。

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