崔文靜，張 矯，馬祥敏，王雯雯，王 欣

(天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市腫瘤防治重點實驗室，天津300060)

RNA干擾(RNAi)是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)對靶基因轉(zhuǎn)錄后的mRNA降解，從而抑制靶基因表達的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。將siRNA的質(zhì)粒、病毒表達載體或帶有siRNA表達盒的PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)入細胞，由細胞表達產(chǎn)生RNA干擾作用［1］。siRNA表達載體常用在哺乳動物細胞中表達shRNA(short hairpin RNA)的含有RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)啟動子的載體［2］，shRNA在細胞內(nèi)被特異核酸酶(Dicer酶)剪切成siRNA而發(fā)揮作用。我們對實驗室常用的shRNA表達載體PLKO.1-puro進行改造，構(gòu)建了含有雙啟動子(人U6和H1啟動子)的shRNA表達載體，實現(xiàn)了兩段shRNA序列的共同表達，以期能提高RNAi效應。

1 材料與方法

1.1 材料 DH5α感受態(tài)細胞(天根生化科技有限公司);PLKO.1-puro質(zhì)粒、pH1RP質(zhì)粒、PCDH-EGFP質(zhì)粒、Hela細胞株，293t細胞株為本實驗室保存;限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，Taq DNA聚合酶、dNTPs、T4 DNA連接酶(Fermentas公司);efusion同源重組試劑(百慧生物科技公司);引物由Invitrogen公司合成;小鼠抗GFP一抗，小鼠抗人β-actin一抗(天津三箭生物);抗小鼠熒光二抗(Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)自帶);DMEM培養(yǎng)基(北京Neuronbc公司);胎牛血清(民海生物);胰酶(Hyclone)。其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 PLKO.1-H1載體的構(gòu)建 以人源的H1啟動子基因序列為模板設(shè)計引物，引物序列如下:上游引物H1-F:AAGGCCAGTGTTTTTCTAGAAATCTGAATTATTTCGGAATTCGAACGCTGACGT，下 游 引物H1-R:TGTCTCGAGGTCGAGTCGACGATATATACGCGTAGATCTGTGGTCTCATAC。以pH1RP質(zhì)粒為模板，H1-F及H1-R為上下游引物行PCR擴增H1啟動子，下劃線部分為帶入的酶切位點(上游的XBaⅠ和EcoRⅠ以及下游的MluⅠ和SalⅠ酶切位點)。以EcoRⅠ酶切PLKO.1載體，回收線性化載體與PCR片段H1同源重組，使得U6和H1啟動子串聯(lián)排列，構(gòu)建含有U6和H1雙啟動子的shRNA載體，命名為PLKO.1-H1(圖1)。

圖1 PLKO.1-H1載體模式

1.2.2 shS1-H1-shS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用Sigma公司網(wǎng)站的siRNA設(shè)計軟件設(shè)計兩對針對EGFP基因不同位點的shRNA序列shEGFP1(正義鏈5'-CCGGGCTACGTCCAGGAGCGCACCACTCGAGTGGTGCGCTCCTGGACGTAGCTTTTT-3'，反義鏈 5'-CTAGAAAAAGCTACGTCCAGGAGCGCACCACTCGAGTGGTGCGCTCCTGGACGTAGC-3')和shEGFP2(正義鏈5'-CGCGAGCCACAACGTCTATATCATGCTCGAGCATGATATAGACGTTGTGGCTTTTTT-3'，反義鏈 5'-TCGAAAAAAAGCCACAACGTCTATATCATGCTCGAGCATGATATAGACGTTGTGGCT-3')，分別破壞 AgeⅠ和SalⅠ酶切位點。同時設(shè)計兩對無干擾作用的片段 shS1(正義鏈 5'-CCGGTCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTT-3'，反義鏈 5'-CTAGAAAAACCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGA-3')和 shS2(正義鏈 5'-CGCGTAGACGGAGGCTTACAGTCTGGCTCGAGCCAGACTGTAAGCCTCCGTCTTTTTTG-3'，反義鏈 5'-TCGACAAA-AAAGAC-GGAGGCTTACAGTCTGGCTCGAGCCAGACTGTAAGCCTCCGTCTA-3')作為對照，AgeⅠ和 SalⅠ酶切位點保留。將上述4對shRNA片段分別互補退火，得到4組shRNA片段。以AgeⅠ和XbaⅠ雙酶切PLKO.1-H1制備線性載體后，首先與shS1片段以T4 DNA連接酶連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，通過Amp抗性篩選陽性克隆小提質(zhì)粒，得到PLKO.1-shS1-H1質(zhì)粒載體。經(jīng)酶切鑒定后再以MluⅠ和SalⅠ雙酶切PLKO.1-shS1-H1質(zhì)粒制備線性化載體，并與shS2片段連接，得到 shS1-H1-shS2重組質(zhì)粒載體。

1.2.3 shEGFP1-H1-shEGFP2重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以AgeⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶及MluⅠ和SalⅠ內(nèi)切酶分別雙酶切shS1-H1-shS2質(zhì)粒制備線性載體，并分別與shEGFP1和shEGFP2片段以T4 DNA連接酶連接，得到shEGFP1-H1-shS2和shS1-H1-shEGFP2重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切鑒定后再以MluⅠ和SalⅠ雙酶切shEGFP1-H1-shS2質(zhì)粒制備線性載體，與shEGFP2片段以T4 DNA連接酶連接，得到shEGFP1-H1-shEGFP2重組質(zhì)粒。

1.2.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 以AgeⅠ和XbaⅠ內(nèi)切酶以及MluⅠ和SalⅠ內(nèi)切酶分別雙酶切上述四種重組質(zhì)粒鑒定，由于shEGFP1寡核苷酸鏈合成時破壞了AgeⅠ酶切位點，而shS1寡核苷酸鏈合成時保留了 AgeⅠ酶切位點，因此以AgeⅠ和XbaⅠ酶切鑒定上述四種重組質(zhì)粒時，shEGFP1-H1-shS2/shEGFP1-H1-shEGFP2質(zhì)粒酶切后被線性化，而shS1-H1-shS2/shS1-H1-shEGFP2重組質(zhì)粒則可以切出大小兩個片段。由于shEGFP2寡核苷酸鏈合成時破壞了SalⅠ酶切位點，而shS2寡核苷酸鏈合成時則保留了SalⅠ酶切位點。因此以MluⅠ和SalⅠ對上述四種重組質(zhì)粒進行酶切鑒定時，shS1-H1-shEGFP2/shEGFP1-H1-shEGFP2質(zhì)粒酶切后被線性化，而shS1-H1-shS2/shEGFP1-H1-shS2重組質(zhì)粒則可以切出大小兩個片段。0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。選擇酶切鑒定成功的重組質(zhì)粒進行序列測定。

1.2.5 細胞培養(yǎng)及穩(wěn)定細胞系的建立 首先建立Hela-EGFP細胞系。293t細胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素)于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前1 d，將對數(shù)生長期的293t細胞以8×106/孔接種于6孔盤，第2天細胞融合達50%時將PCDH-EGFP慢病毒表達載體用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒顆粒。感染前1 d將Hela細胞株以1.5×106/孔接種于6孔板，第2天細胞融合達30%時以EGFP慢病毒顆粒感染Hela細胞株，G418藥篩2周得到穩(wěn)定的帶有綠色熒光的Hela-EGFP細胞系。同樣用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將重組shRNA慢病毒表達載體shEGFP1-H1-shS2、shS1-H1-shEGFP2、shEGFP1-H1-shEGFP2及 shS1-H1-shS2轉(zhuǎn)染入293t細胞，轉(zhuǎn)染后48 h收集病毒顆粒感染Hela-EGFP細胞，嘌呤霉素2 μg/mL藥篩1周得到四種穩(wěn)定的細胞系。在熒光顯微鏡下觀察各個試驗組之間的熒光變化。

1.2.6 EGFP蛋白表達的測定方法 將上述四種穩(wěn)定細胞系分別接種于10cm培養(yǎng)盤，1.8×107/盤，48 h后提取細胞總蛋白，紫外分光光度法測取蛋白濃度。分別取總蛋白15 μg于聚丙烯酰胺凝膠(5%聚合膠，15%分離膠)中電泳后轉(zhuǎn)至NC膜。以5%脫脂牛奶(TBS-T稀釋)封閉膜1 h后加入小鼠抗GFP一抗(1∶5 000稀釋)和小鼠抗人β-actin一抗(1∶10 000稀釋)孵育1 h，洗滌后加入抗小鼠熒光二抗孵育1 h，用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜顯像，Western blot方法行EGFP蛋白表達水平的半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果 以AgeⅠ和XbaⅠ酶切鑒定上述四種重組質(zhì)粒時，shEGFP1-H1-shS2/shEGFP1-H1-shEGFP2質(zhì)粒酶切后被線性化，而shS1-H1-shS2/shS1-H1-shEGFP2重組質(zhì)?？梢郧谐龃笮蓚€片段。而以MluⅠ和SalⅠ對上述四種重組質(zhì)粒進行酶切鑒定時，shS1-H1-shEGFP2/shEGFP1-H1-shEGFP2質(zhì)粒酶切后被線性化，而shS1-H1-shS2/shEGFP1-H1-shS2重組質(zhì)粒則可以切出大小兩個片段。經(jīng)測序證實插入的4個shRNA片段堿基序列與設(shè)計序列完全一致(圖2)。

圖2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2 細胞熒光強度測定結(jié)果 在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，比較在同一曝光條件下細胞的熒光強度(圖3)，可見與對照組shS1-H1-shS2相比，試驗組shEGFP1-H1-shS2及shS1-H1-shEGFP2細胞熒光強度及發(fā)熒光的細胞數(shù)量均明顯降低，與這兩組相比shEGFP1-H1-shEGFP2試驗組細胞熒光強度降低得更加明顯。由此可以初步證明含有兩段不同靶特異干擾序列的雙啟動子shRNA載體干擾效應大于單個靶特異干擾序列的shRNA載體。

圖3 干擾EGFP表達結(jié)果

2.3 EGFP蛋白表達水平 與對照組shS1-H1-shS2相比，試驗組 shEGFP1-H1-shS2及 shS1-H1-shEGFP2的EGFP熒光蛋白表達量明顯降低，而與這兩組相比，shEGFP1-H1-shEGFP2試驗組的EGFP熒光蛋白表達量降低更加明顯。見圖4。通過對EGFP蛋白表達水平的半定量分析，進一步證明了含有兩段不同靶特異干擾序列的雙啟動子shRNA載體的協(xié)同干擾效應。

圖4 干擾EGFP表達Western blot結(jié)果

3 討論

RNA聚合酶Ⅲ啟動子能在體內(nèi)外高效快速地轉(zhuǎn)錄某些小片段基因，這類啟動子相對簡單，完全位于轉(zhuǎn)錄序列上游，因而轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不含來自啟動子的序列;另外遇到3～6個連續(xù)的T就會終止轉(zhuǎn)錄，不需要轉(zhuǎn)錄終止信號，很適合制備短的RNAs。最常用的RNA聚合酶Ⅲ啟動子包括哺乳動物U6 snRNA基因啟動子、人7SK基囚啟動子和H1 RNA基因啟動子等。本次試驗研究所應用的PLKO.1-puro表達載體即由U6啟動子引導shRNA的合成，由于載體上還攜帶了由hPKG啟動子引導的puromycin抗性篩選標記，可以方便的獲得穩(wěn)定表達shRNA的細胞株。

有研究表明，利用相對排列的RNA聚合酶Ⅲ啟動子構(gòu)建載體，可以在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄siRNA，并且可以達到較高的 RNA干擾效率［3，4］。國內(nèi)亦有學者構(gòu)建了U6和H1相對排列的雙啟動子載體，均以其間插入的靶序列為模板，分別轉(zhuǎn)錄出其正義和反義鏈，形成功能性siRNA，并可有效干擾相應基因的表達［5］。我們在這些研究的基礎(chǔ)上，成功構(gòu)建了U6和H1串聯(lián)排列的雙啟動子shRNA表達載體PLKO.1-H1，同時將在體外互補退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩段shRNA片段分別插入U6啟動子和H1啟動子的下游，并由各自的啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。據(jù)實驗結(jié)果顯示，含有兩段不同靶特異干擾序列的雙啟動子shRNA載體干擾效應優(yōu)于單個靶特異干擾序列的shRNA載體，可以得出雙啟動子shRNA載體存在協(xié)同干擾效應的結(jié)論。而雙啟動子shRNA表達載體的作用并不限于此。

隨著siRNA表達載體的快速發(fā)展，RNAi技術(shù)在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域的應用越來越廣泛。如在基因功能分析［6］、研究信號傳導通路的新途徑［7］、新藥物的研究與開發(fā)［8］、治療病毒感染［9］及治療腫瘤等方面的作用。其中RNAi技術(shù)在腫瘤防治方面的研究越來越受重視，如BCR-ABL雜合基因的形成導致酪氨酸激酶活性增高而致病 ，針對 BCR-ABL的siRNA可有效治療該類白血?。?0］。腫瘤的發(fā)生是多因素、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，往往需要多個序列不相關(guān)的基因同時沉默才能達到治療效果。我們所構(gòu)建的雙啟動子shRNA載體可以實現(xiàn)雙基因表達水平的同時降低，減少了載體DNA的重復使用，提高了基因治療的安全性。

總之，我們通過這種模式化工具載體的建立，不僅實現(xiàn)了兩個siRNA片段的協(xié)同干擾，同時為RNAi技術(shù)用于腫瘤的基因治療提供了更加簡便、經(jīng)濟、安全的橋梁。此亦指導我們思考在載體中插入更多的RNA聚合酶Ⅲ啟動子構(gòu)建成多啟動子的shRNA表達載體，是否可以實現(xiàn)多個基因表達水平的同時降低，從而進行更加復雜的RNAi研究。

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