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        超濾配合LC-MS/MS法測(cè)定普伐他汀人血漿蛋白結(jié)合率

        2013-05-22 03:39:00謝展雄陳桂紅彭巧華吳鐵松溫中明深圳龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院廣東深圳58000深圳寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院廣東深圳58000深圳光明新區(qū)人民醫(yī)院廣東深圳58000
        中國(guó)藥房 2013年14期
        關(guān)鍵詞:普伐他汀游離血漿

        謝展雄,陳桂紅,彭巧華,吳鐵松,溫中明(.深圳龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院,廣東 深圳 58000;.深圳寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院,廣東 深圳 58000;.深圳光明新區(qū)人民醫(yī)院,廣東 深圳 58000)

        普伐他汀鈉(Pravastatin sodium,結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1 A)是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)抑制劑,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成中的關(guān)鍵限速酶HMG-CoA還原酶從而影響羥甲基戊二酰輔酶A還原成羥甲戊酸(MVA),使膽固醇在肝細(xì)胞內(nèi)合成減少,適用于飲食限制仍不能控制的原發(fā)性高膽固醇血癥或合并有高甘油三酯血癥的患者(Ⅱa和Ⅱb型)[1-2]。由于肝臟是合成膽固醇的最主要場(chǎng)所,普伐他汀鈉因水溶性特點(diǎn)而對(duì)肝細(xì)胞具高度的選擇性,在膽固醇生物合成中發(fā)揮較強(qiáng)的HMG-CoA還原酶的抑制作用,從而明顯降低血中膽固醇含量[3]。但普伐他汀在血中蛋白結(jié)合率高,以蛋白結(jié)合型的藥物存在血中會(huì)影響其跨膜運(yùn)轉(zhuǎn),從而影響其在肝細(xì)胞中的分布。因此,普伐他汀血漿蛋白結(jié)合率對(duì)其臨床療效有一定影響。已有研究報(bào)道應(yīng)用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)法檢測(cè)人血中的普伐他汀鈉濃度[4-6],但并未見(jiàn)LC-MS/MS法應(yīng)用于普伐他汀鈉血漿蛋白結(jié)合率研究,筆者現(xiàn)探討如下。

        圖1 普伐他汀鈉和瑞舒伐他汀結(jié)構(gòu)式A.普伐他汀鈉;B.瑞舒伐他汀Fig 1 Structure of pravastatin sodium and rosuvastatinA.pravastatin sodium;B.rosuvastatin

        1 材料

        1.1 儀器

        Waters Quattro Micro液-質(zhì)聯(lián)用儀,配有電噴霧電離(ESI)(美國(guó)Waters公司);Waters 2695高效液相色譜儀,包括四元泵,PAD二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、Masslynx 4.02工作站(美國(guó)Waters公司);M37610-33渦旋混合器(美國(guó)Thermo Scientific公司);Sigma 2-16 K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);Sartorius BP 211 D型十萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯天平有限公司);HGC-96 A氮吹儀(上海禾工科學(xué)儀器有限公司);DK-S23型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);Milli-Q純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司);Amicon Ultra-30離心超濾管(美國(guó)Millipore公司)。

        1.2 藥品與試劑

        普伐他汀鈉對(duì)照品(批號(hào):20110612,純度>98%)、瑞舒伐他?。▋?nèi)標(biāo),批號(hào):20100609,純度>99%,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1 B)均購(gòu)于上海研晶生物科技有限公司;普伐他汀鈉片(中美上海施貴寶制藥有限公司,批號(hào):20111026,規(guī)格:每片20 mg)。乙腈為色譜純,水為超純水,其余試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 色譜與質(zhì)譜條件

        色譜柱:Waters XTerra MS C18(150mm×2.1mm,5μm);Waters Symmetry C18保護(hù)柱(20 mm×3.9 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲酸銨(含0.2%甲酸)-乙腈(60∶40,V/V);柱溫:40℃;流速:0.3 ml/min;全波長(zhǎng)掃描。

        ESI:正離子模式檢測(cè);毛細(xì)管電壓:3.50kV;錐孔電壓:70.00 V;其人二級(jí)錐孔電壓:3.00 V;六級(jí)桿透鏡電壓:0.3 V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:350℃;錐孔氣流量:50 L/h;脫溶劑氣流量:450 L/h。選擇質(zhì)核比范圍:100~1500 m/z,掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),檢測(cè)通道為普伐他汀鈉m/z 448.2→327.7和瑞舒伐他汀(內(nèi)標(biāo))m/z 483.2→258.6。數(shù)據(jù)由Masslynx 4.02(美國(guó)Waters公司)獲得和處理。普伐他汀鈉和內(nèi)標(biāo)的離子掃描圖譜見(jiàn)圖2。

        圖2 產(chǎn)物離子掃描圖譜A.普伐他汀鈉;B.瑞舒伐他汀Fig 2 Product ion scan spectraA.pravastatin sodium;B.rosuvastatin

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

        準(zhǔn)確稱取普伐他汀鈉和內(nèi)標(biāo)瑞舒伐他汀各1.0 mg,加甲醇分別溶解于100 ml量瓶中,作為儲(chǔ)備母液(普伐他汀鈉質(zhì)量濃度10.0 μg/ml,瑞舒伐他汀質(zhì)量濃度10.0 μg/ml),于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。取普伐他汀鈉儲(chǔ)備母液用甲醇依次稀釋成1.25、3.75、10.00、25.00、50.00、125.00 ng/ml系列濃度作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于4℃冰箱保存待用;將瑞舒伐他汀儲(chǔ)備母液稀釋成200.0 ng/ml作為工作溶液,于4℃冰箱保存待用。低、中、高3個(gè)(1.25、10.00、125.00 ng/ml)質(zhì)量濃度的普伐他汀鈉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液作為質(zhì)控(QC)樣本以備后用。

        2.3 血漿樣品的處理

        健康志愿者給藥前抽取靜脈血5 ml作為空白對(duì)照;給藥后1、2、4、6、12、24 h時(shí)分別分部分抽取靜脈血5 ml,所取全血即時(shí)離心制備血漿,存儲(chǔ)于-20℃冰箱。待測(cè)血漿樣品從冰箱取出,于37℃解凍。A部分:微量加樣器精密吸取500 μl置離心超濾管中,12000 r/min離心10 min;濾液加內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μl,渦旋5 min,置另一離心管中,30℃水浴氮?dú)獯蹈?;殘留物加流?dòng)相150 μl復(fù)溶,12000 r/min離心10 min,得上清液即為游離型藥物血漿樣品;吸取10 μl進(jìn)樣分析。B部分:微量加樣器精密吸取500 μl置另一10 ml的離心管中,加內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μl,加入 100 mmol/L甲酸銨 100 μl,渦旋1 min,再加入叔丁基甲基醚5 ml,渦旋5 min,3000 r/min離心10 min;上清液置另一離心管中,30℃水浴氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑锛恿鲃?dòng)相150 μl復(fù)溶,12000 r/min離心10 min,得上清液即為總的藥物血漿樣品;吸取10 μl進(jìn)樣分析。

        2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

        2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和定量限考察:取空白血漿250 μl,加入普伐他汀鈉系列工作溶液50 μl,配成相當(dāng)于普伐他汀鈉血漿濃度為0.25、0.75、2.00、5.00、10.00、50.00 ng/ml的血漿樣品,分別按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法處理,并進(jìn)樣分析。記錄峰面積,以待測(cè)物濃度(x)為橫坐標(biāo),待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo),用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸,得游離型、總的藥物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.0277123 x-0.0100645(r=0.9995)、y=0.0212767 x+0.0006445(r=0.9985)。結(jié)果表明,普伐他汀鈉血藥濃度分別在0.25~50.00 ng/ml、25.00~50.00 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;定量限為0.25 ng/ml。

        2.4.2 專屬性:分別將空白血漿、空白加樣、游離型血漿樣品和總藥物型血漿樣品分別按“2.3”項(xiàng)下相對(duì)應(yīng)的方法處理,進(jìn)樣分析,結(jié)果見(jiàn)圖3。在MRM模式下,血漿中普伐他汀鈉和瑞舒伐他?。▋?nèi)標(biāo))能夠很好地分離,峰形良好,無(wú)血漿內(nèi)源性物質(zhì)峰干擾。其保留時(shí)間分別為普伐他汀鈉1.0 min和瑞舒伐他汀1.3 min。

        圖3 MRM模式下典型色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿+普伐他汀鈉對(duì)照品+內(nèi)標(biāo);C.游離型血漿樣品;D.總藥物型血漿樣品;1.普伐他汀鈉;2.瑞舒伐他汀Fig 3 The typical chromatograms in MRM modeA.blank plasma;B.blank plasma+pravastatin sodium control+internal standard;C.free type plasma sample;D.whole type plasma sample;1.pravastatin sodium;2.rosuvastatin

        2.4.3 方法精密度:分別取空白血漿250 μl,加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl,按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法分別處理。同一質(zhì)量濃度樣品于同一天連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)行日內(nèi)精密度分析;同一質(zhì)量濃度樣品于連續(xù)3 d進(jìn)樣,進(jìn)行日間精密度分析。其所得RSD值的范圍為5.0%~13.4%,說(shuō)明方法精密度良好,結(jié)果見(jiàn)表1。

        表1 精密度及回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of precision and recovery tests

        2.4.4 方法回收率:分別取空白血漿250 μl,加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl,按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法分別處理,記錄峰面積,計(jì)算濃度。與相對(duì)應(yīng)的QC樣本溶液進(jìn)行比較,得方法的平均加樣回收率,A部分方法處理:95.2%、87.2%和90.4%,B部分方法處理:87.5%、88.2%和90.7%,詳見(jiàn)表1。

        2.4.5 絕對(duì)回收率和基質(zhì)效應(yīng):分別取空白血漿250 μl,加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl,分別按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法分別處理,進(jìn)樣分析,記錄峰面積。與上述QC樣本溶液直接進(jìn)樣分析所得峰面積進(jìn)行比較,其所得絕對(duì)回收率為(99.4±1.7)%、(99.6±1.6)%、(98.1±2.7)%(A部分方法處理)和(97.1±1.9)%、(98.4±2.2)%、(99.1±2.6)%(B部分方法處理)。QC樣本溶液直接進(jìn)樣分析所得峰面積計(jì)算所得濃度與QC樣本溶液實(shí)際濃度比較即為基質(zhì)效應(yīng),其RSD值分別為13.2%、10.1%、7.8%(A部分方法處理),5.2%、8.5%、6.1%(B部分方法處理),符合藥物體內(nèi)分析方法的規(guī)定。

        2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):分別取空白血漿250 μl,加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的QC樣本溶液50 μl,按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法分別處理,分別于室溫放置8 h,-20℃放置2周及2個(gè)凍融循環(huán),檢測(cè)放置前后濃度變化。結(jié)果,在3種貯存條件下,各濃度樣品未見(jiàn)明顯的變化。濃度前后變化的偏差小于±15%。說(shuō)明樣品在正常貯存條件下是穩(wěn)定的。

        2.5 蛋白結(jié)合率

        6名健康成人志愿者空腹口服給藥(20 mg)后按上述時(shí)間間隔抽取靜脈血,按“2.3”項(xiàng)下A部分和B部分方法分別處理,并進(jìn)樣分析。普伐他汀鈉蛋白結(jié)合率=(總的普伐他汀鈉血漿濃度-游離型普伐他汀鈉血漿濃度)/總的普伐他汀鈉血漿濃度。1、2、4、6h時(shí)結(jié)果分別(50.5±5.7)%、(51.2±3.5)%、(49.8±6.8)%、(52.4±10.1)%。

        3 討論

        藥物血漿蛋白結(jié)合率是藥物與血漿蛋白結(jié)合的量占藥物總濃度的百分率,是藥動(dòng)學(xué)的重要參數(shù)之一。它影響藥物在體內(nèi)的分布、代謝與排泄,從而影響其作用強(qiáng)度和時(shí)間,并往往與藥物的相互作用及作用機(jī)制等密切相關(guān)。因此,藥物血漿蛋白結(jié)合率的研究無(wú)論對(duì)于新藥研究開發(fā)還是指導(dǎo)臨床合理用藥都具有重要意義。本試驗(yàn)利用超濾方法處理樣品配合靈敏的LC-MS/MS法檢測(cè)而得游離型普伐他汀血漿濃度,并與溶劑法處理所得總的藥物濃度相比較。所得結(jié)果可以看出不同時(shí)間普伐他汀血漿蛋白結(jié)合率約50%左右,保持一種較穩(wěn)定的狀態(tài),其原因可能是隨著藥物被機(jī)體不斷代謝,與血漿蛋白結(jié)合的藥物又不斷游離出來(lái),從而使游離型和結(jié)合型的藥物比例保持相對(duì)不變。普伐他汀的血漿清除半衰期約為1.5~2 h左右,由于普伐他汀被機(jī)體代謝的原因,志愿者一次性口服給藥后12 h和24 h的時(shí)間點(diǎn)未能檢出普伐他汀,因此,無(wú)法計(jì)算這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血漿蛋白結(jié)合率。

        超濾是一種篩孔分離過(guò)程,主要用來(lái)截留分子質(zhì)量高于500的物質(zhì)。通過(guò)高速離心所施加的壓力讓游離的藥物濾過(guò),而大分子的蛋白和藥物和蛋白結(jié)合物也被除去。其本身有去除蛋白的作用。但超濾法的使用時(shí)因、壓力問(wèn)題而造成部分結(jié)合型藥物又游離出來(lái),從而對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。

        本文應(yīng)用超濾和溶劑法處理血漿樣品配合LC-MS/MS檢測(cè)技術(shù),建立了一種專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、簡(jiǎn)單快速的普伐他汀鈉的臨床血藥濃度檢測(cè)方法,通過(guò)檢測(cè)游離型的藥物濃度和血中總的藥物濃度,可用于測(cè)定其在健康志愿者血中的蛋白結(jié)合率。

        [1]毛利東.普伐他汀的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2010,5(15):180.

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