劉亞舉，史紹杏，魏鵬飛

（1.許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌 461000；2.南陽市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 南陽473000）

法醫(yī)物證檢案中，中速定性濾紙、采集卡以及FTA卡是常用的樣本載體，但因其各有優(yōu)缺點，批量血樣擴增步驟繁瑣、成功率不高，本實驗采用GoldeneyeTM16C試劑盒對這幾種常用載體進行直接擴增，以提高分型成功率。

1 材料與方法

1.1 樣本

2009年7月—2010年7月本研究所受理案件的建庫血樣2770份，室溫保存。樣本載體均為紙質(zhì)，包括中速定性濾紙1 200份、公安部物證鑒定中心采集卡800份、長春博坤公司經(jīng)典型采集卡600份、FTA卡170份。

1.2 主要儀器與試劑

BSD-QP型打孔機（澳大利亞BSD公司），Hamilton STAR-LET自動化工作站（瑞士AusBio公司），PCR擴增儀（德國 Eppendorf公司），3500XL型遺傳分析儀、GeneMapper?ID-X分析軟件（美國AB公司）。GoldeneyeTM16C試劑盒（北京基點認知技術(shù)有限公司）。

1.3 方法

上述血樣用BSD-QP型打孔機按直徑1.2 mm取樣，檢材置于96孔板管孔內(nèi)。每板中待測樣本90孔，陰、陽性對照置于F12和G12孔內(nèi)，等位基因標(biāo)準(zhǔn)分型物 Ladder分別置于 H3、H6、H9、H12 孔內(nèi)。

采用GoldeneyeTM16C系統(tǒng)進行復(fù)合擴增，反應(yīng)體系為10μL：PCR反應(yīng)緩沖液4μL，引物混合物2μL，Taq聚合酶 0.12 μL，去離子水 3.88 μL。 熱循環(huán)參數(shù)為：95℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，70 ℃ 1 min，29 個循環(huán)；60 ℃ 60 min。 取 1 μL PCR 產(chǎn)物、0.5 μL ROX500內(nèi)標(biāo)和8.5μL去離子甲酰胺混合，95℃變性3 min后，冰浴3 min，電泳檢測，用GeneMapper?IDX軟件進行等位基因分析。

2 結(jié) 果

經(jīng)GoldeneyeTM16C系統(tǒng)檢驗不同載體的DNA血樣，中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡共1800份樣本全部得到完整分型結(jié)果，公安部物證鑒定中心采集卡有46份樣本未得到完整分型結(jié)果，F(xiàn)TA卡全部未得到分型結(jié)果。

將未得到完整分型結(jié)果的46份公安部物證鑒定中心采集卡樣本按2.0 mm直徑取樣，方可獲得完整分型結(jié)果（圖1）。FTA卡1.2mm直徑取樣，經(jīng)純水室溫浸泡2 h，棄上清液，95℃ 5 min后，也獲得滿意分型結(jié)果（圖2）。所獲得的分型結(jié)果峰型均尖銳清晰，并且平衡性好，大部分峰高分布在1000～7000RUF。

圖1 物證鑒定中心采集卡血樣分型圖譜

圖2 FTA卡血樣分型圖譜

3 討 論

目前，全國DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)快速發(fā)展，而實驗室往往需要對血樣進行批量處理。在河南DNA實驗室中，血樣載體主要為中速定性濾紙，其次為公安部物證鑒定中心采集卡和經(jīng)典型采集卡，受價格因素影響很少用FTA卡。FTA卡血樣不僅含有血紅素、血紅蛋白，而且也有EDTA、Tris和SDS等，水洗血樣后降低了這些抑制因素，從而獲得完整分型。由于公安部物證鑒定中心采集卡紙質(zhì)較厚、滲透能力差、單位面積的細胞少，所以加大取樣可以提高成功率。在實際工作中，打孔之前，預(yù)先將96孔板管孔潤濕，并將打孔氣閥調(diào)至可以聽到流出氣體的聲音，可以避免由于靜電作用使打孔后的紙片發(fā)生漂移，從而準(zhǔn)確落入到對應(yīng)的96孔板管孔內(nèi)。中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡血樣檢出成功率較高，一方面是其紙質(zhì)較薄，采集的血液能夠均勻浸透于載體上，屬于雙面血痕，單位血樣中的細胞含量較多；另一方面是1.2 mm直徑的紙片能牢固固定于96孔板管孔底部，添加擴增試劑時和平板離心機離心排除氣泡后紙片可始終完全浸沒于PCR反應(yīng)液中，充分保證了模板的擴增效果。

在批量血樣的DNA檢驗過程中，建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢驗程序，選擇適當(dāng)?shù)膬x器設(shè)備，配合簡潔有效的檢驗方法也至關(guān)重要。本研究選擇直接擴增程序，以“打孔、擴增、電泳”為主線，細化檢驗程序，統(tǒng)籌安排檢驗步驟，標(biāo)準(zhǔn)化操作。針對紙質(zhì)血樣載體直接擴增方法，本研究使用了GoldeneyeTM16C系統(tǒng)，該系統(tǒng)是針對降解、微量檢材和陳舊血樣而設(shè)計的，擴增時間平均為140min，在擴增過程中能很好地排除抑制物干擾，提高檢測成功率和峰高均衡性。此外，3500XL型遺傳分析儀對Ladder和陰、陽性對照的設(shè)置有明確要求，運用其ID-X分析軟件既可以對檢驗數(shù)據(jù)查重又可以檢查檢驗過程中是否有污染，對所分析的數(shù)據(jù)進行復(fù)核，經(jīng)分析復(fù)核無誤的數(shù)據(jù)即可導(dǎo)入DNA數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)中。

本實驗結(jié)果表明，GoldeneyeTM16C系統(tǒng)對中速定性濾紙和經(jīng)典型采集卡均能獲得較為理想的分型結(jié)果，具有檢驗程序簡單、方法高效簡潔、成功率高等優(yōu)勢，實現(xiàn)了“打孔、擴增、電泳”的簡化步驟，可以節(jié)省實驗室檢驗耗材成本、減輕人員勞動強度，能夠縮短檢驗周期、提高工作效率，滿足基層DNA實驗室建庫需求，在法醫(yī)學(xué)實踐中有很好的應(yīng)用前景。