（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001）

5-羥色胺（5-hydroxytrptamine，5-HT）是重要的單胺類中樞神經(jīng)遞質(zhì)，參與多種中樞神經(jīng)活動(dòng)。研究證明5-HT的功能紊亂與多種精神疾病相關(guān)[1-4]。色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase，TPH）是 5-HT 合成的第一個(gè)也是唯一的限速酶，因此，TPH基因表達(dá)正常與否直接影響5-HT的合成量，進(jìn)而影響其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能[5]。過(guò)去一直認(rèn)為T(mén)PH來(lái)源于單基因（現(xiàn)在指 TPH1），直到 2003 年，Walther等[6]發(fā)現(xiàn)第二種TPH亞型——TPH2。人類TPH2基因位于12q21.1，全長(zhǎng)93.5kb，包含11個(gè)外顯子。TPH2主要在腦干表達(dá)，負(fù)責(zé)中樞5-HT的合成，因而TPH2基因也成為與5-HT功能紊亂相關(guān)的精神疾病遺傳學(xué)研究中的一個(gè)重要的候選基因。

本研究擬通過(guò)直接測(cè)序的方法調(diào)查T(mén)PH2基因5′、3′端遺傳多態(tài)性在中國(guó)北方漢族群體的分布情況，為相關(guān)疾病分析提供遺傳學(xué)參數(shù)，同時(shí)探討其法醫(yī)學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

244例中國(guó)北方漢族無(wú)血緣關(guān)系健康個(gè)體肘靜脈血液樣品，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院提供。枸櫞酸鈉抗凝、酚-氯仿有機(jī)溶劑提取法提取白細(xì)胞的基因組DNA。

1.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)特異性引物，分別擴(kuò)增TPH2基因 5′端 905bp和 3′端 1104bp的兩個(gè)目的片段。5′端上游引物序列為 5′-TGCATAGAGGCATCACAGGA-3′，下游引物序列為 5′-AGCAGGGGGTACTAGAGGG-3′；3′端上游引物序列為 5′-ATTACCCGTCCCTTCTCA-3′，下游引物序列為 5′-CAAGCACTGGGACGAAT-3′。 擴(kuò)增體系20 μL，其中包括LA-Taq DNA聚合酶（大連寶生物工程有限公司）0.2μL（1U）、10×緩沖液 2μL、dNTP 1.6 μL、DNA 模板 2 μL（5～10 ng）、上下游引物各 1.6μL（0.5pmol/μL）、去離子水 11μL。PCR 反應(yīng)在T-Gradient梯度PCR儀（德國(guó)Biometra公司）上進(jìn)行。5′端目的片段熱循環(huán)條件為94℃ 1min；94℃ 1min，67℃ 40s，72℃ 1min，33 個(gè)循環(huán)；72℃ 2min。3′端目的片段熱循環(huán)條件為94℃ 1 min；94℃ 1 min，64℃40s，72℃ 1min，33 個(gè)循環(huán)；72℃ 2min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后應(yīng)用原PCR擴(kuò)增引物在3130遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行雙向測(cè)序分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

根據(jù)測(cè)序結(jié)果運(yùn)用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型頻率和等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。按 Odelberg 法計(jì)算雜合度（H）、個(gè)體識(shí)別率（DP）、非父排除率（PE）和多態(tài)信息含量（PIC）。按 Nei和ChaKraborty法計(jì)算雜合度。應(yīng)用Halpoview v4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TPH2基因5′和3′端SNP位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

244例中國(guó)北方漢族個(gè)體測(cè)序結(jié)果顯示除已報(bào)道的 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724G/C）6個(gè)SNP位點(diǎn)外，在92922位點(diǎn)檢測(cè)到1例C/T變異（表1，圖1），由于其等位基因頻率小于1%，因此考慮為突變。另外，在92999G/A位點(diǎn)未檢出AA基因型，說(shuō)明該基因型在中國(guó)北方漢族群體比較少見(jiàn)。

表1 TPH2基因5′、3′端變異位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果

圖1 TPH2基因92922C/T位點(diǎn)雜合子序列分析圖

2.2 TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)多態(tài)性調(diào)查結(jié)果

TPH2基因6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率見(jiàn)表2，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P>0.05）。

表2 中國(guó)北方漢族群體TPH2基因6個(gè)SNP位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率 （%）

2.3 TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析

應(yīng)用Halpoview v4.2軟件對(duì)TPH2基因6個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，結(jié)果顯示，5′端3個(gè)SNP位點(diǎn)之間和3′端3個(gè)SNP位點(diǎn)之間存在緊密連鎖（圖2）。因此，確定兩個(gè)單倍型分區(qū)分別為Block1和Block2。相應(yīng)的單倍型頻率和基因型頻率見(jiàn)表3。

2.4 TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)

根據(jù)TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體的遺傳多態(tài)性分布情況，計(jì)算各位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。其中－703G/T、93329G/A和5′、3′端SNP位點(diǎn)分別構(gòu)成的單倍型均具有較高的個(gè)體識(shí)別率和非父排除率。

圖2 TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)連鎖不平衡示意圖

表3 中國(guó)北方漢族群體TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)分別構(gòu)成的單倍型和基因型頻率

表4 TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)及單倍型的群體遺傳學(xué)參數(shù) （n=244）

3 討 論

3.1 TPH2基因 5′、3′端 SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體的分布情況

SNP是繼DNA指紋圖、微衛(wèi)星之后的第三代遺傳標(biāo)記，作為全新一代遺傳標(biāo)記具有分布廣、多態(tài)信息含量豐富、突變率低、易于判型、適于快速高流量檢測(cè)等特點(diǎn)，目前成為醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等研究的熱點(diǎn)。

本研究采用直接測(cè)序的方法調(diào)查T(mén)PH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體的分布情況。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，共檢測(cè)到7個(gè)變異位點(diǎn)，其中6個(gè)位點(diǎn)具有遺傳多態(tài)性，分別為 rs4570625（－703G/T）、rs11178997（－473T/A）、rs11178998（90A/G）、rs41317118（92999 G/A）、rs17110747（93329G/A）和 rs41317114（93724 G/C）。 rs11178997、rs41317114 為轉(zhuǎn)換，rs4570625、rs11178998、rs41317118、rs17110747 為顛換。上述 6 個(gè)SNP位點(diǎn)均位于TPH2基因的調(diào)控區(qū)，包括啟動(dòng)區(qū)、非翻譯區(qū)及側(cè)翼序列，因此不會(huì)改變蛋白質(zhì)序列，但可能會(huì)參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在92922C/T位點(diǎn)的變異僅在1例樣本中檢出，說(shuō)明該位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體不具有遺傳多態(tài)性。另外，在rs41317118位點(diǎn)未檢出AA基因型，說(shuō)明該基因型在中國(guó)北方漢族群體比較少見(jiàn)。通過(guò)連鎖分析發(fā)現(xiàn)，6個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡系數(shù) D’絕對(duì)值介于 0.02～1.0，其中 rs4570625、rs11178997、rs11178998位點(diǎn)相互之間和rs41317118、rs17110747和rs41317114位點(diǎn)相互之間的D’值均為1.0，說(shuō)明上述位點(diǎn)之間緊密連鎖。

根據(jù)TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體的分布情況，經(jīng)Halpoview v4.2軟件計(jì)算，TPH2基因5′端的3個(gè)SNP位點(diǎn)共構(gòu)成4種單倍型，分別為T(mén)TA、GTA、TAG和GAG，但單倍型GAG的頻率小于1%，因此推測(cè)TPH2基因5′端SNP位點(diǎn)主要構(gòu)成3種單倍型，這與Scheuch等[7]報(bào)道一致。TPH2基因3′端的3個(gè)SNP位點(diǎn)共構(gòu)成4種單倍型，分別為 GGG、GAG、GGC、AAG。

本實(shí)驗(yàn)獲得的中國(guó)北方漢族群體TPH2基因5′、3′端SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率以及單倍型頻率，并對(duì)相關(guān)疾病的關(guān)聯(lián)分析提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

3.2 TPH2基因 5′、3′端 SNP 位點(diǎn)的法醫(yī)學(xué)意義

根據(jù)TPH2基因5′、3′端6個(gè)SNP位點(diǎn)在中國(guó)北方漢族群體的分布情況，計(jì)算出各位點(diǎn)及其單倍型的雜合度、多態(tài)信息含量、個(gè)體識(shí)別率及非父排除率。其中rs4570625位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別率為0.616、非父排除率為0.148，rs17110747位點(diǎn)的個(gè)體識(shí)別率為0.557、非父排除率為0.112，5′端3個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型的個(gè)體識(shí)別率為0.792、非父排除率為0.252，3′端3個(gè)SNP位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型的個(gè)體識(shí)別率為0.752、非父排除率0.239，說(shuō)明上述兩個(gè)位點(diǎn)和兩種單倍型均具有較高的個(gè)體識(shí)別率和非父排除率，可用于法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。

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