李 輝 ，徐紅梅 ，趙 赟 ，李備栩 ，周懷谷 ，趙子琴

（1.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場應(yīng)用技術(shù)公安部重點實驗室 上海市現(xiàn)場物證重點實驗室，上海 200083）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在人類基因組中的總數(shù)超過300萬[1]，且遺傳穩(wěn)定性更高，在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可作為STR基因座的有力補充手段。印記基因是指親緣依賴性單等位基因表達，即只有一個父源性或母源性等位基因表達，印記基因的表達不符合經(jīng)典的孟德爾遺傳定律，其表達與否取決于其親代來源。DNA甲基化是基因印記的重要標志，DNA甲基化差異的區(qū)域被稱為差異甲基化區(qū)域（differentially methylated region，DMR）。 Huang等[2]應(yīng)用PIA法檢測H19基因上游片段4個SNP位點，成功對父源和母源印記基因進行了判定，表明等位基因親緣差異性DNA甲基化聯(lián)合毗鄰的SNP位點多態(tài)性在法醫(yī)親權(quán)鑒定中有良好的應(yīng)用前景[3]。

rs220030位點位于小核核糖核蛋白多肽N基因（small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N，SNRPN）上游啟動子區(qū)域，rs220030位點上游存在若干CpG，其鄰近的rs220028已被證實可用于親緣等位基因判定[4]。本研究先運用DGGE技術(shù)對97例上海地區(qū)漢族家系血樣的rs220030位點進行定性分型，同時運用焦磷酸測序技術(shù)對其中的25例血液來源的家系樣本的rs220030位點進行定量分型并加以比較，結(jié)合重亞硫酸鹽修飾方法通過焦磷酸測序分析三聯(lián)體家系樣本rs220030位點上游CpG甲基化狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性，判斷rs220030是否可用于親緣等位基因的判定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

9700型PCR擴增儀（美國AB公司），DCode通用突變檢測系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），紫外凝膠成像儀（上海復(fù)日科技有限公司），PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀、QIAamp DNA Micro試劑盒、EpiTect Bisulfite試劑盒（德國QIAGEN公司），PCR擴增試劑盒（上海天根生化科技有限公司）。

1.2 樣本及DNA提取

收集97例上海地區(qū)漢族人群家系血樣（25例血液樣本由瑞金醫(yī)院提供，72例血痕樣本由司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所提供），其中有29個三聯(lián)體家系樣本和2個五代家系樣本。運用QIAamp DNA Micro試劑盒提取DNA。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank序列資料提供的rs220030位點正反向序列信息，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計一對DGGE測序引物，由上海生工生物技術(shù)公司合成（表 1）。 應(yīng)用 PyroMark Assay Design Software 2.0軟件設(shè)計4對焦磷酸測序引物（1對用于SNP分型，3對用于檢測rs220030上下游CpG甲基化狀態(tài)），由上海英駿生物技術(shù)公司合成（表2）。

1.4 PCR擴增

DGGE的PCR反應(yīng)體系為10μL：DNA模板4μL，正反向引物各0.5μL，PCR反應(yīng)混合液5μL。擴增條件：95℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 60s，35 個循環(huán)；95℃ 5min。

焦磷酸的 PCR 反應(yīng)體系為 50 μL：H2O 34.8 μL，緩沖液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2 μL，Taq 酶 0.2 μL。 擴增條件：95℃ 5 min；95℃30s，53℃ 30s，72℃ 60s，38 個循環(huán)；72℃ 7min。

1.5 DGGE技術(shù)SNP分型

采用DGGE技術(shù)對97例家系樣本rs220030位點進行分型，變性梯度凝膠由10%聚丙烯酰胺［V（丙烯酰胺）∶V（雙丙烯酰胺）=37.5∶1］配制而成，變性劑含量梯度范圍35%～65%，100%變性劑包含7 mol/L尿素、40%去離子甲酰胺，1×TBE作為電泳緩沖液加熱到60℃，10μL PCR擴增產(chǎn)物與2μL 6×溴酚藍二甲苯青上樣緩沖液混勻后點樣，電泳電壓170V，電泳時間210min。電泳結(jié)束后，凝膠經(jīng)EB染色30min后，用紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.6 焦磷酸測序技術(shù)SNP分型

采用焦磷酸測序技術(shù)對25例血液來源的家系樣本rs220030位點進行分型，根據(jù)PyroMark AQ模式設(shè)計好程序并在試劑倉內(nèi)加好程序給定劑量的反應(yīng)酶底物和dNTP等試劑，并通過PyroMark AQ-SNP模式讀取分析結(jié)果。

1.7 重亞硫酸鹽修飾

隨機選擇2組血液來源的家系樣本用EpiTect Bisulfite試劑盒進行重亞硫酸鹽修飾。反應(yīng)體系為140 μL（85 μL 亞硫酸鹽混合液，35 μL DNA 保護緩沖液，20μL DNA模板），根據(jù)試劑盒說明書完成操作。

1.8 修飾后樣本PCR擴增

擴增反應(yīng)體系 50μL：H2O 34.8μL，緩沖液 10μL，dNTP 1μL，P1 1μL，P2 1μL，DNA 模板 2μL，Taq酶0.2μL。第一個CpG所在序列的反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 60s，38 個循環(huán)；72℃ 7min。第二、三個CpG所在序列的反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 60s，38 個循環(huán)；72℃ 7min。

1.9 甲基化狀態(tài)的焦磷酸測序分析

重亞硫酸鹽修飾后樣本經(jīng)PCR擴增后上機檢測，根據(jù)PyroMark CpG軟件設(shè)計好程序，在試劑倉內(nèi)加好程序給定劑量的所需反應(yīng)酶底物和dNTP等試劑，并通過PyroMark CpG軟件讀取分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 DGGE電泳結(jié)果

97例家系樣本經(jīng)DGGE技術(shù)檢測，在電泳圖譜中顯示1條或4條清晰電泳譜帶，1條譜帶為純合子（根據(jù)分子量大小，靠下的為C純合子，靠上的為T純合子），4條譜帶為雜合子（2條為同源雙鏈，2條為異源雙鏈），部分樣本結(jié)果見圖1。97例家系樣本基因分型結(jié)果為：C純合子20例、T純合子29例以及C/T雜合子48例。

圖1 rs220030位點分型的DGGE電泳圖譜

2.2 焦磷酸測序SNP分型結(jié)果

25例血液來源的家系樣本經(jīng)焦磷酸測序SNP分型，分型結(jié)果與DGGE分型結(jié)果一致，部分樣本結(jié)果見圖2。

2.3 焦磷酸測序分析rs220030位點上游CpG甲基化狀態(tài)結(jié)果

2組家系樣本（家系1、家系2）經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾后，經(jīng)焦磷酸測序分析，rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)結(jié)果見圖3、表3。

圖2 rs220030位點分型的焦磷酸測序SNP分型結(jié)果

圖3 家系1母親樣本rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)

表3 家系樣本rs220030上游甲基化狀態(tài)（%）

3 討 論

3.1 rs220030位點的DGGE技術(shù)SNP分型

變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)作為一種經(jīng)典的電泳SNP分型技術(shù)，對于小規(guī)模、低通量的SNP分型或者突變檢測中具有一定的實用性。DGGE是利用DNA片段雙螺旋解鏈溫度（Tm）的差異進行突變分析。DNA片段在變性梯度凝膠中電泳時，起初雙螺旋DNA片段以恒定速率向前遷移，在抵達變性效果相當于其Tm值的變性劑濃度點時，雙鏈DNA開始部分解鏈而呈分支狀使其遷移速度極度減緩，幾乎處于“停頓”狀態(tài)。長度相同的DNA片段，即使僅存在單個堿基改變，也將影響鄰近堿基間的相互作用，導(dǎo)致Tm值改變，從而使DNA片段在相同電泳時間內(nèi)因不同位移而得以分離[5]。趙赟等[6]運用DGGE技術(shù)與TaqMan探針技術(shù)對100例上海漢族人群rs220030位點進行分型得出群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，證明該SNP位點滿足法醫(yī)親權(quán)鑒定和個人識別的需要。本研究運用DGGE技術(shù)對97例家系樣本進行rs220030位點分型，檢測出1條電泳譜帶的為純合子（靠下的為C純合子，靠上的為T純合子），4條電泳譜帶的為雜合子（2條為同源雙鏈，2條為異源雙鏈）。同時本研究在引物的5′端加入一段40 bp的GC-clamp序列可立刻提高其對單堿基突變的檢測效率，與Sheffield等[7]得出相同結(jié)論。

3.2 焦磷酸測序技術(shù)SNP分型的優(yōu)勢

焦磷酸測序（pyrosequencing）是一種實用的短序列實時檢測技術(shù)，能夠準確定量檢測出單個SNP位點的多態(tài)性[8]。在SNP分型上，DGGE技術(shù)存在操作過程繁瑣、通量低、一次僅能檢測十多個樣本、變性梯度凝膠配制難度大等問題，而焦磷酸測序技術(shù)一次測序只需設(shè)計一對擴增引物和一個測序引物即可，不需要制膠、毛細管、熒光染料和同位素，易于構(gòu)建標準化的操作流程進行大樣本群體SNP分型，靈敏度高、準確性高、精確性好。與傳統(tǒng)的直接測序法比較，焦磷酸測序技術(shù)可以讀出引物結(jié)合以后的臨近堿基，更有助于對小片段的精確定性，而傳統(tǒng)的直接測序法在引物結(jié)合位置后的20個堿基左右通常不可讀。本研究針對25例血液來源的家系樣本進行焦磷酸測序，C純合子結(jié)果為 C：100%，T：0%；T純合子結(jié)果為 C：0%，T：100%；C/T雜合子結(jié)果為C和T百分比各占一半左右（C：58%，T：42%）。 結(jié)果與 DGGE 技術(shù)檢測結(jié)果一致，但相比DGGE技術(shù)，進行焦磷酸測序操作過程簡單直接，無需配制變性梯度凝膠，無需反復(fù)摸索電泳條件，并且在結(jié)果觀察上，相比觀察DGGE電泳譜帶可能出現(xiàn)偽帶的情況，焦磷酸測序結(jié)果更為直觀。

3.3 焦磷酸測序技術(shù)分析CpG甲基化狀態(tài)

應(yīng)用焦磷酸測序?qū)pG甲基化狀態(tài)進行分析，結(jié)合重亞硫酸鹽修飾方法，用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶（C）修飾為尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不變，經(jīng)過PCR擴增后，尿嘧啶（U）將變成胸腺嘧啶（T），由此單個CpG甲基化狀態(tài)的分析就轉(zhuǎn)化為普通SNP位點的C/T單堿基多態(tài)性分析，其中等位基因C的頻率即為基因甲基化的程度，能夠準確定量分析出待測基因的CpG甲基化狀態(tài)[9]。本研究對經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾的2組家系樣本進行rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)進行分析，單個CpG等位基因C的頻率即為該CpG上胞嘧啶甲基化程度，如家系1母親樣本3個CpG的C等位基因頻率分別為66%、64%、55%，表示這3個CpG胞嘧啶的甲基化程度分別為66%、64%、55%。

3.4 rs220030位點上游CpG甲基化親緣相關(guān)性

通常親子鑒定中假設(shè)父不具備生父基因，即可排除親子關(guān)系，但在某些情況下如母親和孩子為相同基因型的雜合子時，則生父、生母基因無法確定。聯(lián)合分析毗鄰印記基因座的親緣特異性甲基化標記和多態(tài)性遺傳標記，可解決單親家系親代與子代為相同基因型的雜合子時，生父、生母基因無法確定的問題[10]。人類基因組中，CpG二核苷酸在基因啟動子區(qū)和第一外顯子區(qū)域等一些特定區(qū)域常成簇出現(xiàn)，形成CpG富集現(xiàn)象，稱為CpG島（CpG island），以往對親緣差異性甲基化的研究主要集中在CpG島。rs220030位于SNRPN基因上游啟動子區(qū)域，Nakayashiki等[11]研究發(fā)現(xiàn) 5 個印記基因（H19、HYMAI、MEST、SNPRN、PEG）內(nèi)有7個以上SNP可用于親緣等位基因判定，其中的rs220028與rs220030毗鄰，rs220030位點雖然不在CpG島上，但rs220030與rs220028之間有3個散在的CpG。本研究應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)對經(jīng)過重亞硫酸鹽修飾過的2組三聯(lián)體家系樣本rs220030上游CpG甲基化狀態(tài)進行檢測，分析其親緣相關(guān)性，子代3個CpG的甲基化程度與母親3個CpG的甲基化程度接近（表3），表明子代3個CpG的甲基化來源于母親。從而說明了在啟動子區(qū)域內(nèi)CpG島鄰近的散在CpG也可能存在甲基化親緣相關(guān)性，結(jié)合毗鄰的SNP位點，有用于親緣等位基因判定的可行性。

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